角蛋白酶酶活测定条件的研究

■冀勇良 刘丽英 朱传合

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安271018；2.山东农业大学生命科学学院，山东泰安271018)

角蛋白酶是一种具有将羽毛等角蛋白物质酶解为短肽和氨基酸的特殊蛋白酶，在饲料[1]、医药[2]、制革[3]、肥料、环保、食品以及洗涤剂等行业具有十分重要的应用[4]，近年成为研究的热点。然而目前，国内外尚没有统一的角蛋白酶活测定标准，很多研究者采用不同的测定方法、条件和酶活单位，造成不同研究结果之间很难进行比较和交流。虽然有相当一部分研究者喜欢采用以Gradisar[5]为代表的测定方法。但该方法在测定条件的适用范围、表述的详实上也存在一定的不完善甚至错误。例如对体系振荡频率只是含糊的表述为“定时取出用力振荡”，对选用羽毛粉粒度的大小、底物浓度是否饱和以及酶活测定时不同试剂的添加顺序也没作具体说明，经实验发现这些因素对酶活测定的结果都有着很大的影响，这样会使同一酶样的测定结果相差过大而难以比较。鉴于上述出现的实际问题，本研究以Gradisar等[5]的方法为基础，系统地研究了多种因素对一株短小芽孢杆菌所产角蛋白酶酶活测定的影响，以期建立一种准确、简便、快速的角蛋白酶酶活测定方法，为从事该领域研究的人员提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 羽毛及羽毛粉

菜市场家禽屠宰点收集生鸡毛，用自来水洗净后80℃烘干，用于发酵产酶。烘干后的生鸡毛再用粉碎机粉碎后过筛即制成羽毛粉，用于测定酶活。

1.1.2 菌种

短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus，JYL），从堆积腐烂羽毛的土壤中分离筛选。

1.1.3 培养基

种子培养基：氯化钠5 g、蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、水1 000 ml，pH值7.0。

初始发酵培养基：NaCl 0.5 g、KH2PO40.35 g、K2HPO40.7 g、MgSO40.2 g、CaCl20.02 g、羽毛5 g、水1 000 ml，121℃高压灭菌20 min，pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 种子液制备

取一环斜面活化的菌种，接入到含50 ml种子培养基的250 ml三角瓶中，37℃、160 r/min培养24 h即为种子液。

1.2.2 液体发酵及粗酶液制备

取2 ml上述种子液接于含100 ml初始发酵培养基的250 ml三角瓶中，37℃，160 r/min培养36 h。发酵液4℃、10 000 r/min离心15 min,上清液即为粗酶液。

1.2.3 角蛋白酶酶活测定的基本方法

以Gradisar等（2000）[5]的方法为基础。取1 ml粗酶液，加入2.0 ml 0.05 mol/l Tris-HCl缓冲液(pH值7.5)，然后加入10 mg羽毛粉，在40℃恒温水浴锅中反应1 h（定时取出用力振荡），加入2.0 ml 10%的三氯乙酸（TCA）终止反应。6 000 r/min离心20 min，取上清液于OD280nm下测定吸光值。采用保温前添加TCA的反应管作为对照。一个酶活单位U定义为在特定反应条件下OD280nm吸光值升高0.01为1unit(U)。

1.2.4 角蛋白酶酶活测定条件的研究

以测定波长（取260～300 nm的范围，每隔2 nm作为一个水平）、物质添加顺序(以底物S、酶E、三氯乙酸TCA、Tris-HCl缓冲液的不同排列设置6个不同处理)、底物粒度（0、20、40、60、80目）、底物添加量（5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mg）、振荡频率（30、20、15、10、5 min）、缓冲液pH值（在6～10的pH值范围取不同值）、酶促反应温度（35、40、45、50、55、60 ℃）、酶促反应时间（15、30、45、60、75、90、105、120 min）、酶液的制备方式（滤纸过滤后离心、直接离心、超声破碎处理）等9个因素作为研究对象，分别进行试验，测定各因素条件下的角蛋白酶酶活。

1.3 原始方法测定蛋白酶酶活值

试验前期以Gradisar等[5]的方法为原始方法，测得蛋白酶酶活值为16.5 U，与本研究结论做比照。

2 结果与分析

2.1 测定波长的选择

目前角蛋白酶酶活测定中，出现许多同波长不同底物，同底物不同波长等混乱现象[6-9]。这是造成不同结果之间难以进行比较的原因之一。本试验以10 mg 20目的羽毛粉为底物，在260～300 nm的波长范围内，按1.2.3中的方法测定同一酶液酶活，绘制波长对吸光度的曲线，结果如图1。由图1可知，酶活测定的吸光值随着测定波长的增加先增加后逐渐变小，在280 nm时有最大吸收，因此选定280 nm作为角蛋白酶酶活测定的波长。

图1 波长对酶活测定的影响

2.2 试剂添加顺序对酶活测定的影响

将底物（S）、酶（E）、Tris-HCl缓冲液（T）按不同的排列顺序（ETS代表先添加酶，再向酶液中加Tris-HCl缓冲液，最后向反应体系中加入底物，其他依次类推）组成酶活测定体系，按1.2.3中的方法测定酶活，结果见图2。

由图2可知，不同的试剂添加顺序对酶活测定结果有较明显影响，按TSE的顺序，即先向反应体系中加入Tris-HCl缓冲液，再将底物加入到缓冲液中，最后加入酶的顺序测得酶活最高。这可能是受酶和底物空间临近效应的影响，缓冲液可以有效的保持酶空间结构不被破坏，从而保持酶的催化活性[10]。羽毛粉底物或反应容器直接与酶接触都会在一定程度上影响和破坏酶分子的空间结构，从而使酶的活性下降。ETS酶活很低可能由于在缓冲液加入前，容器壁与酶长时间接触影响了酶的活性，EST和SET则可能是表面粗糙的羽毛粉底物与酶直接作用，影响或破坏了酶的空间结构。只有先让缓冲液将底物以及反应容器接触面充分浸润后再加入酶，酶才能保持和发挥最大的催化活性。

图2 试剂添加顺序对酶活的影响

2.3 底物粒度对酶活测定的影响

以未经粉碎处理的羽毛做对照，用20、40、60、80目的羽毛粉做底物，试剂添加顺序为TSE，按1.2.3中的方法测定不同粒度下角蛋白酶酶活，结果如图3所示。

图3 羽毛粉粒度对酶活的影响

粒度不同的物质其表面积大小也不同，粒度通过影响底物与酶分子作用的表面积，从而影响酶的催化效率。由图3可以看出，未经处理的羽毛由于粒度较大，酶作用的有效表面积较小，加之羽毛的空间结构未被破坏所以酶很难发挥作用。相比之下羽毛粉的粒度小，相对表面积大，可以有效地被酶降解，但粒度过小（超过40目），虽然表面积增大，但由于羽毛粉的沉积与漂浮作用加强，反而使有效作用的底物离子数目减少。

2.4 底物添加量对酶活测定的影响

米氏方程表达了酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。在测定酶活时，一般选择底物饱和以满足酶活测定的零级动力学条件[11]。在底物饱和的条件下，酶活才正比于酶的浓度，而与底物浓度无关，此时酶促反应的速度达到最大，为零级反应。用同一酶液，按TSE的试剂添加顺序，分别向反应体系中加入不同重量粒度为40目的羽毛粉进行反应，研究底物添加量对酶活测定的影响，结果如图4所示。

图4 底物添加量对酶活的影响

由图4可知，在底物量低于45 mg时，测得的酶活值随底物添加量的增加而增大，此时酶没有被底物所饱和，反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应；当底物添加量达到45 mg时，酶活不再增加，表明酶已被底物饱和，反应速度达到最大，表现为零级反应，酶活趋于极限值。所以45 mg羽毛粉是准确测定角蛋白酶酶活的适宜底物浓度。

2.5 振荡对酶活测定的影响

在测定角蛋白酶酶活时，究竟以间隔多长时间进行振荡最适合酶活测定未见报道。为此，本试验设置了不同的振荡间隔时间以代表不同的振荡反应体系，并以不振荡的处理做对照，代表静止反应体系来研究振荡对酶活测定的影响，结果见图5。

振荡可以使羽毛粉底物均匀地分散在反应体系中，便于酶分子与底物的充分结合，从而在一定程度上利于酶促反应的进行。由图5可知，与静止体系相比，振荡反应体系确实有利于酶促反应的进行，但不同振荡频率之间所测酶活大小并无太显著的差别，说明振荡频率不是影响角蛋白酶酶活测定的显著因素，在没有振荡设备提供下，可以将反应容器定时取出，人工振荡即可满足酶活测定的要求。本试验中每隔15 min进行振荡酶活最高，故选择间隔15 min作为最适振荡频率。

图5 振荡次数对酶活的影响

2.6 缓冲液pH值对酶活测定的影响

角蛋白酶的最适反应pH值以中性到碱性居多，一般为7～10之间，酸性角蛋白酶比较少。本试验在6～10的pH值范围取不同值，以45 mg过40目筛的羽毛粉做底物，按TSE的顺序添加试剂，每隔15 min进行振荡，在40℃下分别测定不同pH值下的角蛋白酶酶活，结果见图6。

反应体系的pH值可以影响底物、酶分子的活性部位以及中间络合物（ES）等相关集团的解离状态，进而对酶的催化反应产生影响，反应体系过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变和酶活性的丧失。由图6可知，pH值在8.5～9.1间酶活较高，而在酸性范围内酶活较低。缓冲液的最适pH值为8.8。

图6 缓冲液pH值对酶活的影响

2.7 反应温度对酶活的影响

不同来源的角蛋白酶其作用的最适温度存在较大的差异，一般都在40～60℃间，目前测定时采用的温度有37、40、50、55 ℃等。本试验以45 mg过40目筛的羽毛粉做底物，缓冲液pH值为8.8，按TSE的顺序添加试剂，每隔15 min进行振荡，分别在不同温度条件下反应1 h，测其酶活结果如图7。

由图7可知，开始时随着反应温度的上升酶活性值也在不断增大，45℃时酶活达到最大值，之后，随着温度上升酶活迅速下降，因此酶的最适温度为45℃。

图7 温度对酶活的影响

2.8 反应时间对酶活的影响

本试验测定了不同反应时间下的酶活值，绘成曲线，结果如图8所示。

图8 反应时间对酶活的影响

由图8可以看出，在15～60 min内曲线基本为一条直线，其斜率代表初速度，按理论可以取15～60 min之内的任何时间[12]，但如果时间过短，则误差比较大，且根据酶活测定的一般原则，测酶活时除了选择底物饱和以消除底物浓度对分析结果的影响外，还应尽可能地延长线性反应的时间[11]，但反应时间过长，经济性较差。因此综合考虑选择60 min作为酶活测定的最适反应时间。

2.9 酶液的制备方式对酶活测定的影响

2.9.1 过滤与离心对酶活测定的影响

用直接离心、直接滤纸过滤、过滤后再离心三种方法制备粗酶液，并分别测其酶活，每个处理3个平行，研究不同酶液制备方法对酶活的影响，结果如图9所示。

图9 酶制备方式对酶活的影响

由图9可知，直接离心制备的酶液活性相对较高，这是因为高速离心不但可以将酶从含羽毛残渣和细菌菌体的发酵液中有效分离出来，而且离心是在4℃相对较低的温度下快速进行，使酶的活性得以很好保持；滤纸过滤或过滤后再离心制得的酶活性要低于直接离心制备的酶，原因可能是，一方面滤纸过滤是在室温下进行，且由于发酵液中残渣物的阻碍，过滤需要相对较长的时间才能完成，使酶长时间暴露在不适的温度下对酶活造成影响；另一方面，滤纸过滤效果不佳，制得的酶液中可能含有相对较多的菌体细胞及其它杂质，影响酶的纯度。所以就方便性和效果而言，采用直接高速离心制备酶液的方法最好。

2.9.2 超声处理对酶活的影响

本试验设置不同的超声功率，分别处理30 s,以无超声处理的做对照，测定直接离心制备的粗酶液酶活，结果如图10所示。

图10 超声功率对酶活的影响

由图10可知，用40、80、120 W的超声波处理发酵液制得酶液的酶活均比未经过超声处理的对照组高，这说明该菌株所产的酶属于胞内胞外混合型酶，40 W时酶活最高，之后随着超声功率的增大酶活性反而降低，超过160 W时酶活已低于对照，这主要因为随着超声功率的增大，超声对酶分子的破坏力也在增大。

3 结论

①试剂添加顺序、底物粒度大小、底物添加量、反应温度、pH值以及超声处理等因素对酶活测定结果具有较大影响，振荡频率和粗酶液制备方式对测定结果影响不大。

②以羽毛粉为底物，测定角蛋白酶酶活的最佳测定条件和步骤为：发酵液用40 W的超声波处理30 s后直接在4℃下，10 000 r/min离心15 min，上清液即为粗酶液；按顺序依次向反应容器内加入2 ml pH值8.8的Tris-HCl缓冲液、45 mg粒度为40目的羽毛粉底物和1 ml酶液，混合均匀后在45℃恒温水浴锅中反应1 h（每隔15 min取出用力振荡），加入2.0 ml 10%的三氯乙酸（TCA）终止反应。6 000 r/min离心20 min，取上清液于OD280nm下测定吸光值。采用保温前添加TCA的反应管作为对照。经验证此方法测得的酶活值为34.8 U，而原始方法测得的酶活值为16.5 U，约是原始方法测定值的2.1倍。