黄腐酸联合黄连解毒散对肉鸡肠道功能影响的研究

■ 侯少岩 袁亚莉 杜朋飞 田红静 王 敬 吴国江*

（1.南华大学化学化工学院，湖南衡阳421000；2.河北农业大学生命科学学院，河北保定071000）

腐植酸（Humic Acid，HA）是由微生物以自然界 中植物残体为原料，分解合成的一类富含羧基、酚羟基、醌基、甲氧基等多种活性基团的天然有机大分子聚合物，按照分子量和在不同溶剂中的溶解度不同可分为黑腐酸、棕腐酸和黄腐酸（Fulvic Acid，FA）。其中，黄腐酸具有调节炎性反应和内分泌活动、刺激免疫反应、参与蛋白合成，提高微生物活性和数量，促进消化吸收等功能。

黄连解毒散（Coptic chinensis antidote）是由黄连（Coptis Chinensis）、黄芩（Scutellaria Baicalensis）、黄柏（Cork）和栀子（Gardenia）四种成分组成，可解实热火毒、三焦热盛之证。现代药理学研究证实其具有抗菌、抗溃疡、解热降压、减少过氧化脂质、增加脑血流量、保护胃黏膜、镇静和止血等作用，这为两者的联合应用提供了科学的理论依据。

胃肠道是机体最大的免疫器官，也是机体营养消化吸收主要场所，所以肠道菌群的平衡不仅能防御病原微生物的侵袭，保护机体不受外界微生物的损伤，同时还可以保护肠道结构的稳定，满足机体营养成分的供给。如果肠道菌群失衡，势必造成肠道免疫机能下降，肠道结构损伤，进而造成机体免疫下降，引发一系列疾病，因此维护肠道菌群平衡，保护肠道结构不受损伤，是避免或减少肠道疾病发生、促进正常生长发育、增强机体抗病能力的重要保障。

本试验利用黄连解毒散肠道菌群调节作用和黄腐酸免疫机能作用，将其有机联合，旨在强化肠道菌群平衡，增强肠道消化酶活力，改善肠道pH值和肠道结构，为保护肠道结构，增强肠道功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂

黄腐酸（由河北农业大学生命科学学院制药工程系提供）、黄连解毒散（黄连∶黄岑∶黄柏：栀子=3∶2∶2∶3）均购自安国市场、雏鸡饲料（徐水县大午公司）、氨苄西林钠（由河北农业大学生命科学学院制药工程系提供）、BBL培养基、MRS培养基、EMB培养基、22.33 g/ml原碘液、0.089 g/ml稀碘液、3.320 g/l可溶性淀粉溶液、pH值6.0磷酸缓冲液、pH值7.5磷酸缓冲液、0.4 mol/l碳酸钠溶液、0.4 mol/l的三氯醋酸液、0.5 mol/l的NaOH、10.00 mg/ml酪素溶液、100 μg/ml酪氨酸标准溶液、聚乙烯醇溶液、10 g/l酚酞指示液、Bouin氏固定液、二甲苯与石蜡混合液（1∶1）。

1.1.2 试验动物及饲料

1日龄非免疫肉仔鸡150只，购自河北某孵化厂；肉鸡配合料购自河北某饲料厂。

1.1.3 主要仪器

恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9240A型,上海飞越实验仪器有限公司）、分光光度计（721型，上海光谱仪器有限公司制造）、台式低速离心机（TD5A-WS型，赛特湘仪离心机仪器有限公司）、电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）。

1.2 测定方法

1.2.1 动物试验模型的建立（见表1）

表1 试验动物模型处理

选择相同品种、品系、体重、健康状态相近的雏鸡共150只。采用雏鸡饲养管理标准饲喂，每日9：00、15：00将药物混入日粮中饲喂42 d。试验结束后，将雏鸡断椎处死，固定于解剖板上，常规消毒，取雏鸡肠道1 g。于正式开始试验当天、第3周末、第6周末清晨空腹称体质量，以重复为单位记录2个阶段的体增重，计算各期平均日增重。

平均日增重（ADG）=（末重-初重)）/试验天数。

1.2.2 肠道菌群统计

分别取各组相应肠段的肠道，称取1 g，放入试管中剪碎，加入9 ml无菌水，于涡旋振荡器上200次/min振荡15 min至肠道内容物均质化，此为10倍稀释，即制成10-1溶液。依次分别稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7溶液，取80 μl溶液在相应培养基上涂布，将乳酸杆菌及双歧杆菌培养基于37℃厌氧培养24 h，大肠杆菌培养基于37℃培养24 h后分别统计各培养基菌落总数并记录，菌落数量在30～300为宜，每个稀释倍数重复3次，并按下列公式换算成每克内容物所含菌落数，取其对数。

每克内容物中菌落形成单位(CFU)＝同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×12.5。

1.2.3 肠道酶活力的测定

分别取各组相应肠段的肠道，称取1 g，放入试管中剪碎，加入9 ml无菌水，于离心机上3 000 r/min振荡5 min，上清液即为待测酶液。

1.2.3.1 蛋白酶活力测定

①标准曲线的绘制

根据表2配制的各种浓度酪氨酸溶液各取1.00 ml(需做平行)，分别加0.4 mol/l Na2CO3溶液5.00 ml，稀福林酚试剂1.00 ml，置(40±0.2)℃水浴中显色20 min，以分光光度计在波长660 nm测定OD值，比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调零点，以OD值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。此曲线应是通过零点的直线，然后计算吸光常数K值[标准曲线中OD为1时的酪氨酸浓度(μg/ml)]，K值一般应在95～100范围内。

表2 不同浓度的酪氨酸的配制

②样品测定

蛋白酶活力的测定采用福林-酚法。37℃、每1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量为1个酶活力单位。

1.2.3.2 脂肪酶活力的测定

脂肪酶活力的测定采用滴定法。37℃、脂肪酶水解脂肪每1 min产生1 μmol脂肪酸的酶量为1个活性单位。

1.2.3.3 淀粉酶活力的测定

淀粉酶活力的测定采用比色法。37℃、30 min水解10 mg淀粉的酶量为1个活性单位。

1.2.4 肠道形态结构

屠宰试验时，剖开腹腔，分离出十二指肠，在其中段截取1 cm左右的肠段，用生理盐水轻轻冲洗肠段内容物，放入准备好的Bouins液中固定。固定好的肠段经脱水，包埋制作石蜡切片，进行HE染色。

切片制作完成后，在光学显微镜下观察比较十二指肠肠黏膜形态结构的情况，并测量绒毛高度（游离于肠腔内的部分，绒毛顶端至绒毛基部）、隐窝深度（肠腺底部至两绒毛之间基部开口处的距离）和肠腺厚度（肠黏膜中的腺体）。

1.2.5 十二指肠pH值测定

取肠道内容物，按1∶10比例加入去离子水稀释，用小型振荡器振荡混合5 min，混合均匀后用PHS-3B型酸度计测定pH值。依次测定嗉囊、鸡胗、十二指肠的pH值。

2 结果

2.1 黄腐酸联合黄连解毒散对肉鸡平均日增重的影响(见表3)

表3 不同组别的平均日增重变化（g）

由表3可知，1～21 d混合组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3组之间平均日增重无显著性差异（P＞0.05）；22～42 d，混合组Ⅰ与空白组相比平均日增重增加了20.89%（P＜0.01），混合组Ⅲ与空白组相比增加了20.03%（P＜0.01)。

2.2 黄腐酸联合黄连解毒散对肉鸡肠道内菌群变化趋势的影响

2.2.1 黄腐酸联合黄连解毒散对肉鸡肠道内双歧杆菌数变化的影响(见表4)

表4 双歧杆菌数量的变化（lgCFU/g）

由表4可知，14 d混合组Ⅰ与空白组相比双歧杆菌数量增加了7.97%；28 d时，黄腐酸组与空白组、中药组、混合组Ⅰ、混合组Ⅱ相比双歧杆菌数量分别增加 了 17.76%(P＜0.05)、13.58%(P＞0.05)、12.54%(P＞0.05)、10.84%(P＞0.05)。

2.2.2 黄腐酸联合黄连解毒散对肉鸡肠道内乳酸杆菌数量变化的影响(见表5)

由表5可知，14 d混合组Ⅱ与空白组相比乳酸杆菌数量增加14.50%(P＜0.01)；28 d混合组Ⅲ与空白组、抗生素组、中药组相比分别增加了11.76%(P＜0.05)、11.33%(P＜0.05)、10.47%(P＜0.05)；42 d混合组Ⅱ与空白组相比增加了6.83%(P＜0.05)。

表5 乳酸杆菌数量的变化（lgCFU/g）

2.2.3 黄腐酸联合黄连解毒散对肉鸡肠道内大肠杆菌数变化的影响(见表6)

由表6可知，14 d中药组与抗生素组相比，大肠杆菌的数量减少15.62%（P＜0.05）。42 d混合组Ⅲ与抗生素组、黄腐酸组、混合组Ⅰ相比，大肠杆菌数量分别降低18.84%（P＜0.05）、21.24%（P＜0.05）、20.79%（P＜0.05）。

表6 大肠杆菌数量的变化（lgCFU/g）

2.3 黄腐酸联合黄连解毒散对肉鸡肠道消化酶活力的影响

2.3.1 黄腐酸联合黄连解毒散对肉鸡蛋白酶活力变化趋势的影响(见表7)

表7 蛋白酶活力的变化趋势（U/ml）

由表7可知，28 d混合组Ⅰ与空白组、抗生素组相比，蛋白酶活力分别增加了64.12%（P＜0.01）、67.08%（P＜0.01）；42 d混合组Ⅰ与空白组、抗生素组、黄腐酸组、中药组相比，蛋白酶活力分别增加了77.94%（P＜0.01）、102.70%（P＜0.01）、30.89%（P＜0.01）、41.51%（P＜0.01）；42 d混合组Ⅰ与混合组Ⅱ及混合组Ⅲ相比，蛋白酶活力分别升高18.95%（P＜0.01）、93.55%（P＜0.01）。

2.3.2 黄腐酸联合黄连解毒散对肉鸡脂肪酶活力趋势的影响(见表8)

由表8可知，14 d混合组Ⅲ与空白组、抗生素组相比，脂肪酶活力分别提高了43.88%（P＜0.01）、53.85%（P＜0.01）；28 d，混合组Ⅲ与空白组、抗生素组相比，脂肪酶活力分别提高了30.86%（P＜0.01）、83.20%（P＜0.01）。

2.3.3 黄腐酸联合黄连解毒散对肉鸡淀粉酶活力变化的影响(见表9)

由表9可知，28 d混合组Ⅱ与空白组、抗生素组相比，淀粉酶活力分别增加了14.38%（P＜0.05）、11.89%（P＜0.05）；42 d，混合组Ⅱ与空白组、黄腐酸组相比，淀粉酶活力分别增加了15.23%（P＜0.05）、11.00%（P＜0.05）。

表8 脂肪酶活力的变化趋势（U/g）

表9 淀粉酶活力的变化（U/dl）

2.4 黄腐酸联合黄连解毒散对肉鸡肠道黏膜结构的影响(见表10)

由表10可知，42 d混合组Ⅰ与抗生素组、黄腐酸组、中药组相比，肠绒毛高度分别提高了32.74%(P＜0.01)、16.21%(P＜0.01)、10.84%（P＜0.01）；混合组Ⅰ与混合组Ⅱ、混合组Ⅲ相比，肠绒毛高度分别提高了17.06%（P＜0.01）、18.55%（P＜0.01）。42 d混合组Ⅰ与空白组、抗生素组、黄腐酸组、中药组相比，隐窝深度分 别 提 高 了 15.84%（P＜0.01）、13.21%（P＜0.01）、32.29%（P＜0.01）、33.85%（P＜0.01），混合组Ⅰ与混合组Ⅱ相比，隐窝深度升高32.14%（P＜0.01）。中药组的肠绒毛高度与隐窝深度比值（V/C）与抗生素组相比，高41.48%（P＜0.01），混合组Ⅱ与混合组Ⅲ相比，V/C值升高33.06%（P＜0.01）。

表10 肠绒毛高度、隐窝深度的比较

2.5 黄腐酸联合黄连解毒散对肉鸡十二指肠pH值的影响(见表11)

表11 十二指肠pH值的比较

由表11可知，抗生素组、中药组最接近中性pH值7.0。混合组Ⅱ与空白组、抗生素组、中药组相比，pH 值分别降低 5.19%（P＜0.05）、3.98%（P＜0.05）、4.52%（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 黄腐酸联合黄连解毒散对肉鸡平均日增重的影响

黄腐酸富含活性物质，能够促进动物体内多种酶的活性和激素的释放，并可减少病原菌毒素对家禽消化吸收的不良影响，使肠道正常菌群、pH值及各种酶的活性更加稳定，有利于饲料养分的消化吸收。黄连解毒散具有抗菌、抗溃疡、解热降压、减少过氧化脂质、增加脑血流量、保护胃黏膜、镇静和止血等作用。本试验结果显示，黄腐酸联合黄连解毒散对于提高肉鸡生长性能有明显效果，22～42 d混合组相比空白组肉鸡平均日增重有不同程度的提高，其原因可能在于黄腐酸联合黄连解毒散的混合制剂中不仅能为肉鸡生长提供必要的营养物质，还能改善起生理代谢，促进消化吸收，从而促进了肉鸡的生长与发育。

3.2 黄腐酸联合黄连解毒散对肠道菌群的影响

本试验结果显示，日粮中添加黄腐酸联合黄连解毒散可提高乳酸杆菌数量，降低大肠杆菌的数量。乳酸菌和双歧杆菌作为有益菌的代表，能促进机体消化功能，提高鸡的生长性能；而大肠杆菌等有害菌则会减弱鸡的生产表现。很多试验也表明，黄腐酸和黄连解毒散均可以增加双歧杆菌和乳酸杆菌数量，降低大肠杆菌数量。

3.3 黄腐酸联合黄连解毒散对肠道消化酶活力的影响

肉鸡日粮中适量添加黄腐酸与黄连解毒散可提高肉鸡小肠内容物淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等酶的活力，利于肠道营养物质消化吸收，提高了肉鸡生长性能。其中黄腐酸对于酶活力的提升作用较为明显，优于黄连解毒散，但二者联合效果更佳，综合考虑各组对三种酶活力提升效果，以混合组Ⅰ对于酶活的提升效果最好。

3.4 黄腐酸联合黄连解毒散对肠道黏膜结构的影响

小肠结构与功能的正常是营养物质被充分消化吸收的基本保证。绒毛高度与隐窝深度反映了肠道的功能状况，其中绒毛高度与成熟细胞数量呈显著相关，因此绒毛短时，成熟细胞少，养分吸收能力低；隐窝深度反映了细胞的生成率，隐窝变浅表明肠上皮细胞成熟率上升，分泌功能增强。V/C则综合反映了小肠的功能状态，比值下降，表示黏膜受损，消化吸收功能下降；比值升高，则黏膜改善，消化吸收功能增强，生长加快。本试验中，混合组Ⅰ与抗生素组相比，肠绒毛高度极显著增加。由此可见，黄腐酸联合黄连解毒散有益于保护和增加肠绒毛高度、增加绒毛高度与隐窝深度的比值，进而提高肠道对养分的吸收利用效率。

3.5 黄腐酸联合黄连解毒散对肠道pH值的影响

黄腐酸是一种有机酸制剂，在消化道中可调节pH值。本试验显示，黄腐酸组与混合组相对其他组pH值均有一定程度下降，可见黄腐酸具有调节消化道中pH值的功能；同时其具有起效快对生物机体无毒副作用的特点，在临床中可以通过控制黄腐酸的加入量调节肠道pH值，抑制病原菌的生长，提高消化酶的酶活力，对幼龄动物早期断乳后适应植物性饲料、促进消化和防止腹泻,促进生长具有重要意义。

4 结论

通过以上试验证明，黄腐酸同黄连解毒散联合使用，可促进肉鸡的生长，提高肉鸡肠道中有益菌的数量，平衡菌群比例，同时也在一定程度上提高了消化酶的活力，强化肠道结构与功能，为黄腐酸与中药的联合应用提供了一定的理论基础。