二补助育汤对胚泡着床障碍小鼠子宫内膜容受性的影响

江 媚 刘雁峰 王铁枫 石 玥

(1 北京市鼓楼中医院，北京，100009； 2 北京中医药大学东直门医院，北京，100700)



二补助育汤对胚泡着床障碍小鼠子宫内膜容受性的影响

江 媚1刘雁峰2王铁枫2石 玥2

(1 北京市鼓楼中医院，北京，100009； 2 北京中医药大学东直门医院，北京，100700)

目的：探讨补肾活血中药方二补助育汤对胚泡着床障碍小鼠子宫内膜容受性的影响。方法：制备小鼠胚泡着床障碍模型，研究其子宫内膜SCFmRNA、HOXA-10 mRNA、LIF、ER、PR、整合素(αvβ3)表达的改变。结果：GnRHa+HMG+HCG超促排方案能降低子宫内膜容受性，而二补助育汤能够调控小鼠子宫内膜调控链间的相关调控因子的表达，从而改善子宫内膜容受性。结论：二补助育汤改善子宫内膜容受性的作用是肯定的，并且其作用途径是多靶点、多环节的。

二补助育汤；体外授精-胚胎移植；子宫内膜容受性；干细胞因子；同源盒基因

子宫内膜容受性是影响胚泡种植率的关键因素之一，所以它越来越受到重视。中医药调节子宫内膜容受性具有明显的优势，但是其作用机制尚不明确。胚胎着床是胚胎植入子宫内膜的复杂生理过程，通过一系列过程完成胚胎与子宫内膜的对话，此过程受诸多因素调节。我们在中医理论基础和临床研究基础上，采用GnRHa+HMG+HCG超促排方案制备动物模型，应用免疫组化法、Real-time PCR等方法和技术，利用所建立的动物模型，研究二补助育汤调控子宫容受性的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用清洁级昆明雌性小鼠60只，8～12周龄，体重24～30 g。由北京维通利华实验技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2012-0001。

1.2 实验药物 二补助育汤：补骨脂、骨碎补、桑寄生、川断、川牛膝、巴戟天、制首乌、郁金、鸡血藤、葛根、升麻，颗粒制剂购自北京中医药大学附属东直门医院门诊药房；达菲林(GnRHa)(规格0.1 mg)，IPSEN PHARMA BIOTECH制药，进口药品H20080638，购自东直门医院药房；补佳乐(戊酸雌二醇)(规格1 mg/片)DELPHARM Lille S.A.S.制药，进口药品H20080108，购自东直门医院药房；阿司匹林肠溶片(规格100 mg/片)拜耳制药，进口药品H20090078，购自东直门医院门医药房。

1.3 方法

1.3.1 动物分组 实验动物共分为7组，分别为：空白组、模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、西药组1(补佳乐组)、西药组2(阿司匹林组)。

1.3.2 动物模型的建立 造模方法：模型组、西药组1、西药组2、中药低、中、高剂量组，观察小鼠阴道涂片，从动情日开始，于每日9时腹腔内注射达菲林(GnRHa)40IU/100 g体重，连续9 d，至第9天联合腹腔注射人绝经期促性腺激素(HMG)1U/100 g体重促排卵，48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)10IU/100 g体重，从而造成胚泡着床障碍模型。

1.3.3 给药方法 本研究采用中药颗粒剂二补助育汤干涉治疗，同时以西药补佳乐及阿司匹林作为对照。方法：于造模同时，空白组和模型组每日灌服0.9%氯化钠溶液0.2 mL，中药低、中、高剂量组每日分别按0.213 g/20 g体重、0.427 g/20 g体重、0.853 g/20 g体重的浓度灌服二补助育汤，西药组1每日灌服补佳乐0.006 mg/20 g体重，西药组2每日灌服阿司匹林0.225 mg/20 g体重，连续10 d。于动物实验第11天，断颈处死小鼠，无菌条件下取子宫，将其中一角子宫纵向剖开，迅速放入液氮中，然后于-80 ℃冰箱保存；另外一角子宫纵向剖开，立即放在4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切片备用。

1.4 指标检测 1)实时聚合酶链反应：采用实时聚合酶链反应(Real-time PCR)技术对比检测不同剂量二补助育汤、补佳乐、阿司匹林作用下子宫内膜干细胞因子(SCFmRNA)及同源盒基因(HOXA-10 mRNA)表达的改变。2)免疫组化：采用免疫组化法对比检测不同剂量二补助育汤、补佳乐、阿司匹林作用下小鼠子宫内膜白血病抑制因子(LIF)、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、整合素(ανβ3)表达的改变。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件，定义P<0.05差异有统计学意义。各组间比较采用方差分析或非参数检验，具有显著性后，再采用LSD法或SNK法进行多重比较。

2 结果

2.1 各组小鼠子宫内膜SCFmRNA表达情况 空白组小鼠子宫内膜SCFmRNA的表达明显高于模型组；西药各组及中药各治疗组小鼠子宫内膜SCFmRNA表达明显高于模型组(P<0.05)；中药低剂量组明显低于中药高、中剂量组子宫内膜SCFmRNA的表达(P<0.05)，但中药中剂量与高剂量组子宫内膜SCFmRNA的表达无统计学意义(P>0.05)；阿司匹林组子宫内膜SCFmRNA表达明显低于中药各剂量组(P<0.05)，补佳乐组子宫内膜SCFmRNA表达明显低于中药高、中剂量组(P<0.05)。见表1。

2.2 各组小鼠子宫内膜HOXA-10 mRNA表达情况 空白组小鼠子宫内膜HOXA-10 mRNA的表达明显高于模型组；西药各组及中药中、低剂量组小鼠子宫内膜HOXA-10 mRNA表达明显高于模型组(P<0.05)；阿司匹林组及补佳乐组小鼠子宫内膜HOXA-10 mRNA表达明显低于中药中、低剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠子宫内膜SCFmRNA及HOXA-10 mRNA表达情况

注：与模型组比较*P<0.05，与空白组比较△P<0.05，与西药1组比较▲P<0.05，与西药2组比较□P<0.05。

2.3 各组小鼠子宫内膜整合素ανβ3表达情况 空白组小鼠子宫内膜整合素ανβ3的表达明显高于模型组；中药各剂量组小鼠子宫内膜整合素ανβ3表达明显高于模型组(P<0.05)；补佳乐组及阿司匹林组子宫内膜整合素ανβ3表达明显低于中药各剂量组(P<0.05)。见表2。

2.4 各组小鼠子宫内膜LIF表达情况 空白组小鼠子宫内膜LIF的表达明显高于模型组；中药中、低剂量组及补佳乐组小鼠子宫内膜LIF表达明显高于模型组(P<0.05)；补佳乐组子宫内膜LIF的表达明显低于中药低剂量组(P<0.05)，阿司匹林组子宫内膜LIF的表达明显低于中药中、低剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠子宫内膜整合素ανβ3及LIF表达情况

注：与模型组比较*P<0.05，与空白组比较△P<0.05，与西药1组比较▲P<0.05，与西药2组比较□P<0.05。

2.5 各组小鼠子宫内膜ER表达情况 空白组小鼠子宫内膜ER的表达明显高于模型组；中药中、低剂量组小鼠子宫内膜ER表达明显高于模型组(P<0.05)；阿司匹林组及补佳乐组子宫内膜ER表达明显低于中药中、低剂量组(P<0.05)。见表3。

2.6 各组小鼠子宫内膜PR表达情况 空白组小鼠子宫内膜PR的表达明显高于模型组；中药各剂量组小鼠子宫内膜PR表达明显高于模型组(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠子宫内膜ER及PR表达情况

注：与模型组比较*P<0.05，与空白组比较△P<0.05，与西药1组比较▲P<0.05，与西药2组比较□P<0.05。

3 讨论

IVF-ET的最终妊娠率与子宫内膜容受性密切相关，而子宫内膜容受性受多个调控因子的调节。其中，整合素ανβ3是重要的细胞黏附因子，其在胚胎植入过程中介导胚泡与子宫内膜的对话，其可能参与胚泡植入的黏附过程，被认为是子宫内膜容受性的标记分子之一[1-2]；张炜等[3]证实了LIF在小鼠孕期的表达明显高于非孕期(P<0.05)；潘一红等[4]发现子宫内膜异位症(EMS)患者种植窗期的子宫内膜、取卵日卵泡液中LIF表达均下降，可能与EMS导致不孕有相关性。这些都表明LIF与子宫内膜容受性关系密切，并且是预测子宫内膜容受性的金标准；ER、PR与子宫内膜容受性的关系基本明确，雌、孕激素可通过ER、PR对子宫内膜进行调节，在月经周期的第19天，子宫内膜腺上皮的ER、PR突然消失，并且其降调与胞饮突同时发生[5-7]。适当浓度的孕酮水平和子宫内膜PR的表达，是子宫内膜蜕膜化的必备条件。

HOXA-10属于腹部B组HOX基因，能参与女性生殖系统的发育以及正常子宫内膜形态的建立，并对子宫内膜的增殖与分化、子宫内膜容受性的建立、胚胎植入的黏附、子宫内膜的蜕膜化发挥至关重要的作用,所以HOXA-10是子宫内膜容受性建立的必备因子[8-9]；SCF与IVF-ET的妊娠结局关系密切，研究发现[10-12]，SCF可能是中医药调节子宫内膜容受性的新靶点。另外，雌、孕激素可能通过ER和PR来调节其下游的HOXA-l0的表达，而HOXA-l0又可能调节下游的COX2、EP3以及EP等PG信号系统使子宫内膜进入着床窗口期，从而利于胚泡的着床。

东直门医院肖承悰教授经过长期临床经验总结发现接受IVF-ET失败的患者主要病机是肾气不足，胞脉不畅，其独创的二补助育汤能使子宫内膜环境与卵泡发育同步，从而利于胚胎的着床及发育[13]。我们前期临床观察发现其有显著的临床疗效，现在通过实验研究得出结论：补肾气，通胞脉中药能显著提高子宫内膜ER、PR、LIF、ανβ3的表达，此四者是子宫内膜容受性建立的标志物，提示二补助育汤改善子宫内膜容受性的作用是肯定的；另外，其能提高子宫内膜SCFmRNA及HOXA-10 mRNA的表达，提示二补助育汤可能是通过调控子宫内膜SCF及HOXA-10的表达来改善子宫内膜容受性，从而使卵泡发育与子宫内膜同步，利于胚泡着床。综上，我们推测这些调控因子相互作用形成调节子宫内膜容受性的调控网络，而补肾气，通胞脉中药通过多方面、多通路作用于子宫内膜，从而改善子宫内膜微环境、调节子宫内膜容受性，而其具体作用机制是多层次、多靶点的。

研究过程中我们采用了长方案(GnRHa+HMG+HCG方案)制备动物模型，但是未建立肾虚血瘀证动物模型，下一步将深入对病证结合动物模型的研究；另外，该方案制备的动物模型不能进行胚泡着床计数，希望在下一步的研究中改进。

[1]隋晓倩,于德钦,张冬梅.子宫内膜容受性各相关标志物研究进展[J].生殖与避孕,2015,35(3):185-190.

[2]王公道,韩旭,黄梦琪,等.子宫内膜容受性标志物的研究进展[J].东南大学学报：医学版,2015,34(2):332-336.

[3]张炜,周剑萍,刘银坤,等.白血病抑制因子在小鼠围着床期子宫内膜的表达[J].生殖医学杂志,2000,9(2):100-103.

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[12]陈婕,谈勇.干细胞因子在女性生殖系统疾病诊疗中的研究进展[J].实用医学杂志,2015,32(19):3254-3255.

[13]江媚,刘雁峰,吕艳莹.浅谈肖承悰教授中药治疗子宫内膜容受性低之经验[J].环球中医药,2013,6(1):22-24.

(2015-12-21收稿 责任编辑：张文婷)

Effect of Erbu Zhuyu Decoction on Endometrium Receptivity of Rats Model with Embryo Implantation Dysfunction

Jiang Mei1, Liu Yanfeng2, Wang Tiefeng2, Shi Yue2

(1BeijingDrumTowerHospitalofTCM,Beijing100009,China; 2DongzhimenHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100700,China)

Objective:To investigate the effects of Erbuzhuyu Decoction on endometrium receptivity of rats model with embryo implantation dysfunction. Methods:Rats model with embryo implantation dysfunction was prepared for the study on expression changes of endometrial SCFmRNA, HOXA-10 mRNA, LIF, ER, PR and ανβ3. Results: GnRHa+, HMG+, HCG scheme may reduce the endometrium receptivity, and Erbu Zhuyu Decoction may regulate regulate the expression of relevant regulating factors in networks of rat endometrial microenvironment to improve endometrium receptivity. Conclusion: Erbu Zhuyu Decoction is bound to have the effect on endometrium receptivity and its activity pathway is multi-targeted and multi-linked.

Erbuzhuyu Decoction; IVF-ET; Endometrium receptivity; SCF; HOXA-10

2012国家自然科学基金项目(编号：81273789)——二补助育汤调节子宫内膜容受性的效应机制及其与SCFmRNA表达相关性研究；2014国家自然科学基金项目(编号：81473721)——基于NK/M-CSF/NO通路的二补助育汤调节子宫内膜容受性效应机制相关性研究

江媚(1986.07—)女，博士，医师，研究方向：中医药治疗女性不孕症、内分泌疾病等，E-mail：18001337209@163.com

刘雁峰(1963.04—)，女，博士，主任医师，教授，博士研究生导师，研究方向：中医药治疗女性不孕症、内分泌疾病等，E-mail：liuyaf8888@sina.com

R285.6

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.11.043