调节性T细胞、白细胞介素-17与婴幼儿喘息样支气管炎辨证分型的关系

张 静

(广东省广州市妇女儿童医疗中心中医儿科，广东 广州 510623)

调节性T细胞、白细胞介素-17与婴幼儿喘息样支气管炎辨证分型的关系

张 静

(广东省广州市妇女儿童医疗中心中医儿科，广东 广州 510623)

目的 探讨调节性T细胞(Treg细胞)、白细胞介素-17(IL-17)与婴幼儿喘息样支气管炎辨证分型的关系。方法 选择健康儿童20名、肺脾气虚型喘息样支气管炎患儿20例及脾肾阳虚型喘息样支气管炎患儿20例，检测其外周血Treg细胞、IL-17含量。6个月后随访各组再次发作喘息患儿的人数及次数，检测其外周血Treg细胞、IL-17含量。结果 3组Treg细胞比较差异均无统计学意义(P>0.05)；肺脾气虚组IL-17高于健康组、脾肾阳虚组(P<0.05)，健康组与脾肾阳虚组IL-17比较差异无统计学意义(P>0.05)。6个月后随访3组Treg细胞比较差异均无统计学意义(P>0.05)；肺脾气虚组IL-17高于健康组、脾肾阳虚组(P<0.05)，健康组与脾肾阳虚组IL-17比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Treg细胞、IL-17与婴幼儿喘息样支气管炎的首次发作及再次喘息发作存在密切关系。在喘息样支气管炎缓解阶段，应用健脾益肺补气的方法对肺脾气虚型患儿进行体质治疗及预防，从根本上改善患儿的生活质量。

哮喘；辨证分型；白细胞介素6；T淋巴细胞

婴幼儿喘息样支气管炎[1]是最常见的儿科呼吸系统疾病，此病有反复发作趋势，部分患儿甚至可能发展为支气管哮喘。因此，为了提高中医对喘息样支气管炎患儿的治疗及预防再次发作喘息，本研究主要观察喘息样支气管炎缓解阶段肺脾气虚型和脾肾阳虚型婴幼儿和正常儿童的外周血中调节性T细胞(Treg细胞)、白细胞介素-17(IL-17)含量，以及其相互之间的关系，旨在探讨Treg细胞、IL-17与婴幼儿喘息样支气管炎辨证分型的关系。

1 资料与方法

1.1 病例选择

1.1.1 诊断指标 西医诊断参照《诸福棠实用儿科学》[2]中喘息样支气管炎诊断标准；中医诊断参照《中医儿科学》[3]中哮喘缓解期诊断标准，辨证分型为肺脾气虚型、脾肾阳虚型[4-5]。

1.1.2 纳入标准 患儿：年龄<3周岁；符合中西医诊断标准及中医辨证分型标准；首次被诊断为喘息样支气管炎收治入院。健康儿童：年龄<3周岁；无喘息发作史；无过敏性疾病；一级亲属无过敏性疾病。

1.1.3 排除标准 支气管异物、喉发育不良、支气管肺发育不良、先天性气道畸形、支气管扩张、重症肺炎等可能引起喘息的疾患；有心、脑、肾基础疾病者；严重的免疫缺陷病和遗传代谢性疾病。健康儿童：父母有哮喘病史；外周血嗜酸粒细胞≥0.04。

1.2 一般材料 选择2014-01-01—2014-06-30到广东省广州市妇女儿童医疗中心儿童保健门诊体检的健康儿童20名，广东省广州市妇女儿童医疗中心呼吸科住院患儿肺脾气虚型和脾肾阳虚型各20例，均首次诊断为喘息样支气管炎。健康组20名，男9名，女11名；年龄1～36个月，平均(23.65±5.02)个月；体质量8～15 kg，平均(11.60±1.63) kg；肺脾气虚组20例，男11例，女9例；年龄1～36个月，平均(22.05±7.10)个月；体质量8～15 kg，平均(11.76±1.53) kg；脾肾阳虚组20例，男12例，女8例；年龄1～36个月，平均(22.20±3.44)个月；体质量8～15 kg，平均(11.18±0.91) kg。3组性别、年龄、体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。6个月后随访肺脾气虚组、脾肾阳虚组再次发作喘息患儿的人数及次数，检测其外周血Treg细胞、IL-17含量，以我院医生门诊病历诊断为喘息性支气管炎纳入再次喘息发作的依据。

1.3 检测方法

1.3.1 Treg细胞 Treg细胞检测试剂盒购自BD Biosciences公司。抽取研究对象外周静脉血2 mL，取50 μL乙二胺四乙酸盐(EDTA)抗凝全血，加入10 μLCD25-FITC，2.5 μL CD4-APC，5 μLCD127-PE，然后混匀，室温避光15 min，后取2 mL溶血素混匀，再室温避光10 min，平衡试管质量后置于水平式离心机内离心1 500 r/min ，5 min，去上清，取2 mL磷酸缓冲盐溶液(PBS)混匀，水平式离心机内离心1 500 r/min，5 min，去上清，450 μL PBS悬浮，最后上机检测。用流式细胞仪CELL Quest Pro软件收集数据并分析。

1.3.2 IL-17 酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购自安迪生物科技(上海)有限公司。IL-17标本采集及细胞分离：抽取全部研究对象外周静脉血2 mL，肝素钠抗凝。全血离心后收集血浆-80 ℃冻存待ELISA检测。本试剂盒使用双抗体夹心法测定标本中IL-17水平。用纯化的IL-17抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入IL-17，再与辣根化氧化物酶(HRP)标记的羊抗人抗体结合，构成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过完全洗涤后加底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)显色。TMB在HRP的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样本中的IL-17呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定光密度值(OD值)，通过标准曲线计算样品中IL-17含量。

2 结 果

2.1 3组Treg细胞、IL-17比较 见表1。

表1 3组Treg细胞、IL-17比较

健康组(n=20)肺脾气虚组(n=20)脾肾阳虚组(n=20)Treg细胞(%)7.7250±1.615187.5195±1.506117.9945±1.36052IL-17(pg/mL)3032.87±814.41*4034.20±1279.002865.77±520.26*

与肺脾气虚组比较，*P<0.05

由表1可见，3组Treg细胞比较差异均无统计学意义(P>0.05)；肺脾气虚组IL-17高于健康组、脾肾阳虚组(P<0.05)，健康组与脾肾阳虚组IL-17比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 肺脾气虚组、脾肾阳虚组随访再次喘息患儿与健康组Treg细胞、IL-17比较 见表2。

表2 肺脾气虚组、脾肾阳虚组随访再次喘息患儿与健康组Treg细胞、IL-17比较 ±s

与肺脾气虚组比较，*P<0.05

由表2可见，3组Treg细胞比较差异均无统计学意义(P>0.05)；肺脾气虚组IL-17高于健康组、脾肾阳虚组(P<0.05)，健康组与脾肾阳虚组IL-17比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

喘息样支气管炎的免疫学基础是辅助性T细胞2(Th2)为主导的免疫反应，气道存在以肥大细胞和嗜酸粒细胞参与为主的气道慢性过敏性炎症[6]。目前认为喘息样支气管炎的反复发作是由于免疫调节紊乱引起的。近几年研究发现，Treg细胞是机体内重要的内源性调节呼吸道炎症过程的细胞，并可能在过敏性哮喘的发病和发展机制中起到关键性作用。Treg细胞[7]通过分泌抑制性细胞因子IL-10、转化生长因子β(TGF-β)和细胞间直接接触介导免疫抑制，IL-10是具有抗炎作用的细胞因子，可抑制促炎细胞因子的合成，亦可抑制嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞及肥大细胞的致炎作用。CD4+、CD25+Treg细胞的主要作用表现为免疫无能性和免疫抑制性，是外周免疫耐受形成机制的主要组成部分。其主要作用机制为分泌抑制性细胞因子(IL-10和TGF-β)、表达细胞表面分子[细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)]及Foxp3等。国外研究发现，TGF-β能诱导Foxp3表达，促进CD4+、CD25+Treg细胞增殖，从而抑制呼吸道嗜酸粒细胞浸润为主的炎症，降低呼吸道变态反应[8]。吴奎等[9]发现哮喘鼠中CD4+、CD25+Treg细胞显著低于正常鼠，还发现Treg细胞相关因子IL-10水平降低。而另一研究[10]亦显示，呼吸道过敏症模型小鼠的体内存在Treg细胞的缺陷，将CD4+、CD25+Treg细胞转移到模型鼠体内可以抑制过敏性炎症的发生。

国外临床研究中哮喘急性发作期及持续期CD4+、CD25+Treg细胞表达较缓解期及正常对照组降低，症状缓解阶段CD4+CD25+Treg细胞表达增加接近正常[11]，由此可见Treg细胞的免疫抑制作用在保持机体的自身耐受性中发挥着决定性作用[12]。彭力等[13]在临床实验中观察喘息婴幼儿CD4+、CD25+Treg细胞百分率的表达显著低于对照组，Treg细胞可能在婴幼儿喘息疾病活动中发挥重要作用，可能参与了婴幼儿喘息的发病机制。而在本研究中显示Treg细胞在健康儿童组外周血中与肺脾气虚和脾肾阳虚组患儿的差别并不大，比较差异无统计学意义(P>0.05)，此结果与彭力等[13]观察喘息婴幼儿Treg细胞明显低于对照组得出的结论有所不同，但由于彭力等[13]观察的指标为喘息发作时进行的检测，而本研究是喘息缓解阶段进行的免疫学检测，这可能提示在婴幼儿喘息缓解后Treg细胞的表达逐渐增加接近正常。这一结果与国外研究哮喘缓解后Treg细胞表达增加接近正常组的结论相近[11]。也进一步提示婴幼儿喘息与哮喘的免疫学指标高度相似。从另一方面也表示在婴幼儿喘息的发作中可能与调节性T细胞数量减少有相关性。

Th17细胞是由Infante-Duarte C等[14]首次提出的一群不表达IL-4或γ-干扰素(IFNγ)，却高水平分泌IL-17的新的Th亚群。Th17细胞的主要效应因子是IL-17。近年来发现，IL-17 是T 细胞来源细胞因子，Th17细胞分泌的IL-17是强大的促炎细胞因子，它可以促使气道黏液腺分泌大量黏液，增加气道的高反应性，从而在哮喘气道重塑的过程中发挥重要作用。施宇衡等[15]发现严重的过敏性哮喘患者Th17细胞的反应增加，Th17细胞及其分泌的细胞因子IL-17为哮喘加重的关键因素。而IL-17基因[16]缺陷小鼠不易引发哮喘，说明在哮喘的发作中Th17细胞发挥了重要作用。但目前国内动物实验[17]亦表明哮喘急性发作期气道IL-17表达和产生增加，介导中性粒细胞性炎症，临床资料证实IL-17在哮喘急性发作期气道表达增加，提示Th17在儿童哮喘发病中可能有重要作用。Th17细胞的发现使我们对疾病免疫发病机制，尤其是婴幼儿喘息样支气管炎的发病机制突破仅有的Thl/Th2模式的局限。过去许多认为是Th1或Th2细胞介导的疾病，现在证实Th17细胞亦起重要作用或主要作用。

本研究中，健康儿童外周血IL-17 与肺脾气虚组比较差异有统计学意义(P<0.05)，与脾肾阳虚组比较差异无统计学意义(P>0.05)。肺脾气虚组再发喘息患儿IL-17含量与健康儿童比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示喘息样支气管炎肺脾气虚型患儿喘息症状的反复发作可能与IL-17含量有明显直接关系。而脾肾阳虚组再发喘息患儿IL-17含量与健康儿童比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示在婴幼儿再发喘息中IL-17与肺脾气虚型患儿的关系比脾肾阳虚型患儿的相关性有可能要更加密切。肺脾气虚组患儿IL-17含量均高于健康组和脾肾阳虚组，而IL-17具有上调黏液基因表达、促进黏液分泌的作用，并可间接促进气道组织纤维化而参与哮喘的气道重塑过程。张亚梅等[18]报道儿童喘息样支气管炎病情严重程度与外周血浆中IL-17表达水平呈正相关，因此IL-17含量的增多对喘息的发作有一定程度的影响。并且在喘息发病中辨证为肺脾气虚型患儿IL-17的高表达也提示此类患儿发展为慢性哮喘的可能性较高，并不利于喘息恢复，所以在治疗预防中要重视此类患儿的体质调理。鲁双喜[19]在玉屏风散对哮喘小鼠Th17相关细胞因子表达影响研究中发现玉屏风散对哮喘小鼠急性期IL-17有抑制作用，能减轻哮喘小鼠肺组织细支气管及血管周围炎性细胞浸润，改善气道炎症状态，减少气道上皮黏液分泌。

在喘息样支气管炎缓解阶段，我们可以应用健脾益肺补气法对肺脾气虚型患儿进行体质治疗及预防，从根本上改善此类患儿的生活质量。

(指导老师：陈晓刚 刘 华)

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(本文编辑：习 沙)

Correlation among regulatory T cells, interleukin-17 and syndrome differentiation of asthmatoid bronchitis in infants

ZHANGJing.

DepartmentofTraditionalChinesePediatrics,GuangzhouMedicalCenterforWomenandChildreninGuangdongProvince,Guangdong,Guangzhou510623

Objective To study the correlation among regulatory T cells (Treg cells), interleukin-17 (IL-17) and syndrome differentiation of asthmatoid bronchitis in infants. Methods 20 healthy infants, 20 asthmatoid bronchitis infants with lung and spleen QI deficiency type and 20 asthmatoid bronchitis infants with spleen-kidney Yang deficiency type were selected. The contents of peripheral-blood Treg cells and IL-17 were measured. The people counting and attack frequency of acute exacerbation of asthma after 6 months follow-up were observed and the contents of peripheral-blood Treg cells and IL-17 were measured. Results There were no statistical differences on Treg cells among three groups (P>0.05). The IL-17 in lung and spleen QI deficiency group was higher than healthy and spleen-kidney Yang deficiency group (P<0.05), and there were no statistical differences on IL-17 between healthy group and spleen-kidney Yang deficiency group (P>0.05). Conclusion There are intimate connection among Treg cells, IL-17 and the first and second attack of asthma in infants with asthmatoid bronchitis. In the remission stage of asthmatoid bronchitis, the therapy of strengthening spleen, invigorating lung and nourishing QI is able to treat and prevent the infants with lung and spleen QI deficiency constitution, which can fundamentally improve the quality of life.

Asthma; Syndrome differentiation; IL-6; T lymphocyte

10.3969/j.issn.1002-2619.2016.11.007

张静(1983—)，女，主治医师，硕士。从事中医儿科临床工作。

R725.6；R725.622.5；R331.125

A

1002-2619(2016)11-1630-05

2016-07-14)