微孔板式微生物法快速检测乳粉中维生素B12含量

姚春华，洪 敏，胡克岐

（浙江公正检验中心有限公司浙江赞宇科技股份有限公司，浙江杭州 310009）

微孔板式微生物法快速检测乳粉中维生素B12含量

姚春华，洪 敏，胡克岐

（浙江公正检验中心有限公司浙江赞宇科技股份有限公司，浙江杭州 310009）

采用博欧实德和拜发2种品牌的微孔板式微生物法定量检测试剂盒，测定市售婴幼儿配方乳粉中维生素B12含量，并进行对比。结果表明，在0.03～0.18μg·100g-1范围内，博欧实德和拜发2种品牌试剂盒检测维生素B12的标准曲线线性良好，检测限为0.03μg·100g-1；重复性试验相对标准偏差分别为4.6%～8.6%和2.9%～4.4%，加标回收率分别为82.5%～105.0%和90.2%～103.0%。2种品牌的试剂盒均能获得较好效果，其中，拜发试剂盒重复性及准确度更佳。相较于传统微生物检测方法，微孔板式微生物法具有方便、快捷等特点，为食品质量控制工作提供一种耗时短、准确性好、灵敏度高的手段。

乳粉；微生物法；微孔板试剂盒；维生素B12

维生素B12（Cyanocobalamin，VB12）又称氰钴胺素，是一组由钴结合咕啉环的红色类咕啉化合物的总称［1］，是维持人体正常代谢和机能不可缺少的一种微量营养素。人体每日所需的维生素B12为3μg左右，使用过量可引起过敏反应，甚至过敏性休克。若缺乏维生素B12，将影响人体对叶酸的利用，还可导致周围神经炎和儿童贫血［2-3］。

目前，国内维生素B12检测方法主要有液相色谱法［1］、酶联免疫法［4］和微生物法［5-10］，其中，微生物法是经典的测定方法，它利用莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis）对维生素B12的特异性和灵敏性，定量测定试样中维生素B12的含量，在测定的特异性、灵敏度和结果准确性等方面是其他方法无法替代的。目前，我国现行的食品安全国家标准GB 5413.14—2010即是利用微生物法测定婴幼儿食品和乳品中维生素B12。但该方法操作过程繁琐，且对菌株活力、测试培养基的优劣、检测所用器皿的清洁程度和试验人员操作有较高要求。本试验选用与国家标准原理相同的2种维生素B12测定试剂盒检测婴幼儿乳粉中维生素B12，通过对精密度、回收率等进行比较，建立一种方便、快捷的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

VersaMax型酶标仪，美谷分子仪器有限公司；BS224S型电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；580R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；JB-CJ-2FC型超净工作台，苏州佳宝净化工程设备有限公司；GRP-9270型隔水式恒温培养箱，上海森信实验仪器有限公司；微量移液器（20～200μL，100～1000μL），德国Eppendorf公司；H111191型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司。

微孔板形式的微生物法定量检测维生素B12试剂盒，德国拜发IFP公司；Biostest维生素B12（氰钴胺素）检测试剂盒，北京博欧实德生物技术有限公司；维生素B12标准物质，纯度为98.4%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；样品为市售婴幼儿乳粉。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

称取1 g均质样品至50 m L无菌离心管中，加入40 m L蒸馏水，摇匀。95℃水浴中提取30 m in，其间振荡至少5次，同时确保离心管塞紧闭。水浴结束后迅速冷却至30℃以下，12 000 g离心10 min。根据样品维生素B12标示浓度，取上清液在1.5 mL Eppendorf管中进一步稀释。

1.2.2 标准溶液的制备

取出试剂盒中自带的维生素B12标准品干粉，按照说明书要求加入相应体积的无菌水，充分摇匀后得到标准品原液。标准品浓缩液稀释方法：取6支1.5 m L Eppendorf管，编号分别为1、2、3、4、5、6，分别加入标准品原液0、100、100、150、200、300μL，再分别加入无菌水900、900、400、350、300、200μL，制得终浓度分别为0、0.03、0.06、0.09、0.12、0.18μg·100 g-1的标准品梯度稀释液，用于制作标准曲线。

1.2.3 测定培养基配制

取出试剂盒中维生素B12培养基，加入10 mL无菌水，盖好培养基瓶，摇匀，95℃水浴5 min，其间振荡至少2次，并确保瓶子密封。迅速冷却至30℃以下，用0.2μm无菌滤膜过滤至15 m L无菌离心管中。

1.2.4 样品测定

取出需要数量的微孔板条在板上固定，移取150μL维生素B12培养基至微孔中，然后移取150μL标准品或稀释的样品至微孔中，用黏合箔盖住板条，于37℃黑暗条件下孵育48 h。孵育结束后，再次盖紧黏合箔，将微孔板翻置在桌面上，在桌面平面上振荡，使微生物均匀分布于培养基中，撕下黏合箔，清除微孔中液体表面的气泡，用酶标仪于630 nm读取各微孔吸光度，绘制标准曲线，计算样品中维生素B12的含量。计算方法如下：

维生素B12（μg·100 g-1）=标准曲线计算的VB12含量（μg）×稀释倍数/样品质量（g）×100

2 结果与分析

2.1 绘制标准曲线

以维生素B12含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线见图1。2种试剂盒的标准曲线在0.03～0.18μg·100 g-1范围内线性均良好，相关系数均在0.99以上。检测限可达到0.03μg·100 g-1。

图1 博欧实德（A）和拜发（B）的维生素B12标准曲线

2.2 重复性

选取4种不同品牌的奶粉，分别用2种试剂盒进行6次试验，测试结果见表1，2种试剂盒检测结果无统计学差异（P＞0.05）。博欧实德试剂盒和拜发试剂盒测定的4种不同奶粉维生素B12相对标准偏差分别为4.6%～8.6%和2.9%～4.4%，拜发试剂盒的重复性相对较好。

2.3 加标回收率

选取已知维生素B12含量的同一奶粉进行3个梯度的加标回收试验，博欧实德试剂盒和拜发试剂盒测定的奶粉样品中维生素B12加标回收率分别为82.5%～105.0%和90.2%～103.0%（表2），表明拜发试剂盒加标回收率较欧博实德试剂盒有更高的平均回收率且具有更小的离散变化。

表1 重复性试验结果

表2 回收率试验结果

3 小结与讨论

运用微生物法检测维生素B12，其准确度与灵敏度取决于实验中乳酸菌接种数量、菌活力、培养基、样品处理方式以及人员操作等因素。商品化的试剂盒虽然根据其工艺水平可以在一定程度上减小各孔细菌活力、培养基等造成的误差，但是操作过程中仍需严格无菌操作，所用移液枪枪头、离心管、过滤器等需提前灭菌，以避免外来微生物的污染；同时需要选择适宜的稀释倍数，吸光度值不宜过低或过高。

商业化试剂盒可以简化操作步骤、缩短检测所需的时间，为食品质量控制工作提供一种耗时短、准确性好、灵敏度高的手段。本研究分别采用博欧实德和拜发2种品牌的微孔板式试剂盒定量检测市售婴幼儿配方乳粉中维生素B12含量，这2种品牌试剂盒在0.03～0.18μg·100 g-1范围内线性良好，相关系数分别为0.992和0.996；检测限为0.03μg·100 g-1；重复性试验中，样品的平行性较好，相对标准偏差分别为4.6%～8.6%和2.9%～4.4%，加标回收率分别为82.5%～105.0%和90.2%～103.0%。2种品牌的试剂盒检测婴幼儿配方乳粉中维生素B12含量均能达到良好的效果，其中，拜发的试剂盒具有更好的重复性及准确度。

［1］ 郭松年，巩泽龙，冯歆轶，等.超高效液相色谱串联质谱法测定婴儿奶粉中的维生素B12［J］.化学分析计量，2014，23（6）：8-10.

［2］ 郝岩平，姜金斗，房玉国.HPLC法测定婴幼儿配方奶粉复合维生素添加剂中维生素B12方法的研究［J］.中国食品添加剂，2004（2）：93-96.

［3］ 储小军，陶保华，赖世云，等.固相萃取-二维液相色谱法测定婴幼儿配方食品中的维生素B12［J］.浙江大学学报（农业与生命科学版），2013，39（2）：185-190.

［4］ 乐振窍，成立静.ELISA法在功能饮料维生素B12测定中的应用［J］.饮料工业，2014，17（10）：30-33.

［5］ 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准：GB 5413.14—2010婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定［S］.北京：中国标准出版社，2010.

［6］ 黄晓林，王淼，张丽宏，等.IFP微孔板试剂盒检测配方乳粉中维生素B12方法探讨［J］.中国乳品工业，2010，38（7）：48-49.

［7］ 吴环，刘冬虹，张慧，等.微生物法快速检测食品中维生素B12含量的应用研究［J］.中国乳业，2014（4）：42-44.

［8］ 李全霞，崔亚娟，赵寅菲，等.微生物法测定食品中水溶性维生素的原理及进展［J］.食品科学，2013，34（13）：338-344.

［9］ 鲁盛静，田野.婴幼儿食品和乳制品中维生素B12测定的探讨［J］.中国乳品工业，2013，41（2）：50-52.

［10］ ESTEVE M J，FARRÉR，FRÍGOLA A，et al.Contents of vitamins B1，B2，B6，and B12in pork and meat products［J］. Meat Science，2002，62（1）：73-78.

（责任编辑：侯春晓）

TS207.3

：B

：0528-9017（2016）12-2096-03

文献著录格式：姚春华，洪敏，胡克岐.微孔板式微生物法快速检测乳粉中维生素B12含量［J］.浙江农业科学，2016，57（12）：2096-2098.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161255

2016-08-09

姚春华（1979—），女，浙江丽水人，工程师，硕士研究生，主要从事食品检验测试工作，E-mail：ych985@163.com。