理化因子对茶尺蠖核型多角体病毒活性的影响

谭荣荣，王友平，毛迎新，王佳璐

（1.湖北省农业科学院a.果树茶叶研究所湖北省农业科技创新中心果茶分中心，b.植保土肥研究所，湖北武汉 430064；2.华中农业大学植物科学技术学院，湖北武汉 430070）

理化因子对茶尺蠖核型多角体病毒活性的影响

谭荣荣1a，王友平1b，毛迎新1a，王佳璐2*

（1.湖北省农业科学院a.果树茶叶研究所湖北省农业科技创新中心果茶分中心，b.植保土肥研究所，湖北武汉 430064；2.华中农业大学植物科学技术学院，湖北武汉 430070）

研究了pH、温度、紫外线和化学试剂处理对茶尺蠖核型多角体病毒活性的影响。结果表明，茶尺蠖核型多角体病毒在pH 7的环境中，活性最强，pH值升高或降低，茶尺蠖核型多角体病毒感染的茶尺蠖幼虫的死亡率都会下降；当水浴温度达80℃时，病毒几乎完全失活；紫外线处理32 h可明显降低病毒活性；在4种化学试剂中，0.1%CuSO4对病毒活力影响较小，经过乙醚和75%乙醇处理后的病毒活力有下降趋势。

茶尺蠖核型多角体病毒；理化因子；病毒活性

茶尺蠖核型多角体病毒（Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus，EoNPV）作为茶园主要害虫茶尺蠖生物防治的重要手段之一，其优点是特异性强、稳定性好、安全无害，能引起害虫群体病毒疾病的流行传播，在相当长时间内可自然控制害虫消长，导致相继世代害虫持续带毒，感染死亡。然而昆虫病毒在自然条件下，易受阳光、雨水及温度等因素的影响，易于失活，残效期不长，直接影响防治效果［1］。

测定EcobNPV在不同理化条件下的稳定性，不仅是其生理生化特性的一个重要方面，也是指导茶尺蠖大田防治的重要依据之一。本研究借鉴前人的方法和技术，以我国湖北茶园主要害虫——茶尺蠖为材料，将部分纯化的EcobNPV进行不同处理，再通过人工感染，测定EcobNPV在不同理化条件下的活性［2-3］。

1 材料与方法

1.1 茶尺蠖病毒悬液制备

茶尺蠖核型多角体病毒利用茶尺蠖幼虫活体增殖，收集病毒感染致死的昆虫尸体，用PBS缓冲液充分研磨后，4层纱布过滤，将滤液置于4℃条件下离心，500 r·m in-1离心5 m in，弃沉淀，上清液再用3 500 r·m in-1离心30 m in。然后用适量缓冲液重新悬浮沉淀，3 500 r·min-1离心30 min。差速离心反复进行多次，直至多角体悬液呈乳白色。病毒用血球计数板计数后，使用等体积PBS缓冲液稀释，于4℃冰箱保存待用。本试验中使用的茶尺蠖病毒水剂，病毒原液浓度为3.6×1010PIB· m L-1，使用终浓度为2×107PIB·m L-1。

1.2 供试虫源与虫龄

室内用茶树鲜叶连续饲养6代以上的茶尺蠖幼虫2龄期。

1.3 处理设计

pH对EcobNPV活性的影响。用0.2 mol·L-1的Na2HPO4和0.1 mol·L-1的柠檬酸按不同比例配置成pH分别为4、6、7、8的缓冲溶液，用HCl配置pH为2的溶液，用NaOH配置pH分别为10、12的溶液。用上述各pH值溶液稀释病毒液至使用终浓度，将稀释后的病毒液置于常温下保存24、240 h后对茶枝叶片进行接毒，饲养茶尺蠖幼虫。

温度对EcobNPV活性的影响。将病毒原液稀释至使用终浓度，盛于烧杯中，分别置于40、50、60、70、80、90、100℃水浴锅中加热，共7个处理。在加热过程中用温度计不断搅拌病毒液并观察温度，待达到设定温度时，使其保持恒温30或60 min后取出冷却供试。

紫外辐射对EcobNPV活性的影响。将涂有病毒多角体（病毒原液）的培养皿放在超净工作台中紫外灯管（30 W，波长为200～300 nm，最强处波长为255 nm）下进行辐射，设置60、120、240、480、960和1 920 m in 6个时间梯度处理，然后将处理过的病毒稀释至使用终浓度待用。

化学试剂对EcobNPV活力的影响。用乙醚、乙醇、CuSO4和甲醛处理，具体处理方法如下：（1）将病毒原液分别用40倍体积的乙醚和75%乙醇静置悬浮4 h，离心除去化学试剂后稀释至使用浓度待用；（2）另取适量病毒原液用0.1%CuSO4稀释至使用浓度后直接处理茶枝叶片；（3）直接取适量病毒原液用蒸馏水稀释至所需浓度，然后甲醛熏蒸3 h对茶枝叶片进行接毒。

2 结果与分析

2.1 不同pH对EcobNPV致病力的影响

pH值升高或降低，对病毒的致病力均有较大影响（表1）。在酸性范围内，随着pH值的升高，幼虫的感染率也随之升高，当pH为4～6时，病毒致死率差异不显著。碱性范围内，随着pH值的升高，对幼虫的致病率显著下降，pH 12条件下处理240 h，病毒几乎完全失活。吕鸿声［4］指出，中性溶液（pH值7）处理的病毒发病率最快，致病性最强，pH值升高或者降低都会影响病毒的感染率，延长潜育期。本研究中，pH值升高和降低均降低了EcobNPV的感染率，pH为6、7和8的溶液对EcobNPV的致病率无显著影响。

表1 不同pH值对EcobNPV致病力的影响

2.2 温度对EcobNPV致病力的影响

温度是影响病毒变性的重要因素之一，温度过高或处理时间过长会造成蛋白质变性，从而使病毒失活。随着温度的升高和处理时间的延长，病毒活性逐渐降低，感病幼虫死亡率也逐渐降低。在处理温度区域内，病毒活力受到不同程度的抑制作用，死亡率与CK（表1）相比明显降低（图1）。80℃水浴处理30 min，幼虫仍有部分死亡，说明该病毒有部分保持了活力，对高温耐受力较强。当温度升至90℃时，EcobNPV完全失活。方差分析表明，60、70和80℃分别处理30 min，各处理之间的病毒致死率差异达极显著水平；60、70和80℃分别处理60 min，各处理之间的病毒致死率差异也均达极显著水平。

图1 不同温度下处理EcobNPV感染茶尺蠖幼虫的死亡率

2.3 紫外线处理对EcobNPV致病力的影响

紫外线辐射对生物伤害或致死的主要原因是使有机体的遗传物质DNA发生变化，从而造成遗传变异或死亡。紫外辐射强度一定时，EcobNPV的活性与照射时间呈负相关，随着照射时间的增长，EcobNPV的活性逐渐降低（表2）。EcobNPV经紫外线照射32 h后，饲毒幼虫的死亡率仅为5.6%，病毒已几乎完全丧失活性。

表2 紫外照射不同时间对EcobNPV致病力的影响

2.4 化学试剂对EcobNPV致病力的影响

不同化学试剂对EcobNPV活性的影响程度不一，但差异不大。0.1%CuSO4、乙醚、甲醛、75%乙醇对EcobNPV都没有较强的灭活作用，处理后病毒液均保持较高的稳定性，其死亡高峰期也相对集中（表3）。能使蛋白质变性的甲醛未能使EgNPV丧失感染活性，致使处理幼虫全部感染病毒死亡，这可能与病毒的外层囊膜结构有关。

表3 不同化学试剂对EcobNPV致病力的影响

3 小结与讨论

作为昆虫病原微生物，病毒在昆虫疾病流行中起着十分重要的作用。因其具有对宿主专一性强、对环境友好等特性，日益为人们所重视，应用前景十分广阔。环境中的各种生态因子，对昆虫病毒的稳定性有明显影响，因此，关于昆虫病毒稳定性的研究是病毒生态学研究中的重要内容［4-7］。本文从pH值、温度、紫外线和化学试剂处理4个方面对茶尺蠖核型多角体病毒的稳定性进行了研究，以期对昆虫病毒流行学研究以及利用病毒制剂进行害虫的持续控制提供依据。研究结果显示，茶尺蠖核型多角体病毒（EcobNPV）对酸碱度和温度有较宽的适应范围，具有良好的稳定性；经紫外线和各种不同的化学试剂处理，也能保持较高的毒性。

温度对病毒活性的影响主要表现在其宿主感染后的死亡率，随着温度的升高和处理时间的延长，病毒活性降低。茶尺蠖核型多角体病毒的稳定性受处理温度和处理时间的共同作用，对一定时间的亚高温（40～60℃）和短时（30 m in以内）的高温（80℃以上）有一定的耐受性。

不同pH毒力影响试验中，处理组幼虫死亡特征为典型的杆状病毒感染所致，病毒在pH 7的环境中活性最强，pH值升高或降低，病毒致病率都会下降；在pH值4和pH 6～8时，其感病幼虫的死亡率没有显著性差异。由此可以得出，在pH值6～8时，EcobNPV的稳定性较高。

紫外线照射能使生物体内产生大量氧自由基，导致瞬时的或不可逆的细胞损伤。本试验中，在适宜条件下（紫外线处理60 min），EcobNPV能至少保持感染活性数小时，然而随着病毒接受紫外线积累量的增加，机体清除这些氧自由基的能力下降、抗氧化能力减弱造成细胞损伤，直至机体死亡。所以当辐射时间延长至32 h时，病毒失去活性。

EcobNPV对常用的化学试剂有较强的抵抗力。分别使用0.1%CuSO4、乙醚、甲醛和75%乙醇进行处理时，病毒仍保持较高的侵染力。可见在自然环境中，该病毒抗逆境的能力较强，普通的去污剂或蛋白质变性剂，均不能使EcobNPV完全灭活。

综上所述，在茶尺蠖核型多角体病毒制剂的加工和野外施用过程中，应注意以下几个问题：（1）在制剂加工过程中注意避免高温环境［8］。水剂可忍受30 min内50℃以下的高温环境，但最好不要超过40℃；（2）在低温环境下保存病毒；（3）在使用时除注意应在低龄幼虫期施用外，更应注意避免在高温烈日下施用，夏季时可在清晨或傍晚进行施药。

［1］ ERLANDSON M.Insect pest control by viruses［M］.Oxford：Academ ic Press，2008.

［2］ 殷灿.美国白蛾核型多角体病毒的稳定性研究［D］.泰安：山东农业大学，2014.

［3］ 殷灿，刘笛，任骥，等.温度对美国白蛾核型多角体病毒活性的影响［J］.山东农业大学学报（自然科学版），2015，46（3）：353-356.

［4］ 吕鸿声.昆虫病毒与昆虫病毒病［M］.北京：科学出版社，1982.

［5］ 孙新城，景建洲，陈小科.杆状病毒的生态学和流行病学研究进展［J］.河南农业科学，2007（10）：16-18.

［6］ 孙修炼，胡志红，彭辉银.杆状病毒生态学研究进展［J］. Virologica Sinica，2006，21（2）：200-206.

［7］ FUXA J R.Ecology of insect nucleo polyhedro viruses［J］. Agriculture，Ecosystems&Environment，2004，103（1）：27-43.

［8］ 殷坤山，陈华才，肖强，等.茶尺蠖核型多角体病毒制剂的试制与推广应用［J］.中国病毒学（英文版），2000（S1）：84-87.

（责任编辑：侯春晓）

S476+.13

：A

：0528-9017（2016）12-2030-03

文献著录格式：谭荣荣，王友平，毛迎新，等.理化因子对茶尺蠖核型多角体病毒活性的影响［J］.浙江农业科学，2016，57（12）：2030-2032.

10.16178/j.issn.0528-9017.20161232

2016-05-25

国家茶叶产业技术体系（CARS-23）；湖北省农业科技创新中心资助项目（2011-620-005-003-04）

谭荣荣（1981—），女，湖北襄阳人，硕士，助理研究员，从事茶树植物保护研究工作，E-mail：tanrongrong1981 @163.com。

王佳璐（1980—），女，重庆人，博士，副教授，从事农业昆虫与害虫防治研究工作，E-mail：wangjialu@mail.hzau.edu.cn。