蛭龙活血通瘀胶囊对脑出血后脑水肿的影响*

王 蔚 杜 渊 白 雪 杨思进△



蛭龙活血通瘀胶囊对脑出血后脑水肿的影响*

王 蔚1杜 渊2白 雪1杨思进1△

目的观察蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑出血后脑含水量、血脑屏障超微结构、血脑屏障通透性的影响。方法将195只大鼠随机分为假手术组、模型组、蛭龙活血通瘀胶囊高、中、低剂量组，各组又分为12h、48h、72h三个亚组，采用自体尾部血注入法制备脑出血大鼠模型，采用干湿重法检测脑含水量，伊文思蓝法对各组进行血脑屏障通透性检测，电子显微镜下观察血脑屏障超微结构的变化。结果与模型组比较，ZL低、中、高剂量组脑含水量均明显降低，差异具有统计学意义，低剂量组12h(P<0.05)，其余各时间点各药物组(P<0.01)；ZL低、中、高剂量组大鼠脑组织EB含量均有明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。ZL各剂量组之间比较，以高剂量组为对照，低、中剂量组在12h、48h及72h具有显著性差异(P<0.01)。电镜超微结构观察发现血管周围水肿程度较为轻微，血脑屏障的结构得到明显改善。结论蛭龙活血通瘀胶囊能够明显减轻脑出血大鼠脑水肿，保护血脑屏障组织结构，避免其通透性破坏，改善血脑屏障功能，该作用存在一定的量效关系，ZL高剂量组作用最为明显。

蛭龙活血通瘀胶囊；脑出血；血脑屏障功能；脑含水量

脑出血是常见的内科急症，临床病理研究证实[1]，脑出血急性期恶化死亡的主要原因是脑水肿及出血。脑出血后在出血区域形成血肿，对周围脑组织造成压迫，引起脑内的急性占位效应，并对周围的脑组织产生进一步的损害，因此脑水肿被认为是脑出血后最重要的继发性病理变化之一，往往成为脑出血病情加重的重要原因。脑出血后周围组织水肿的发生机制与诸多因素有关[2]，其中，血脑屏障破坏被认为是主要的因素之一。本实验研究观察具有益气活血、化瘀通络功效的蛭龙活血通瘀胶囊对大鼠脑出血后脑组织含水量、血脑屏障通透性和血脑屏障超微结构的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级的雄性健康SD大鼠195只，体质量250～300g，由西南医科大学动物实验中心提供，实验动物使用许可证号为SYXK(川)2013-065。动物按照每笼5只进行饲养，室温(22±2)℃，湿度30%～40%，常规饲料喂养，自由摄食及饮水。

1.2 药物及试剂蛭龙活血通瘀胶囊：主要成分包括黄芪、水蛭、地龙、大血藤、桂枝等药物，规格为0.4g/粒，相当于生药 2.625g，由西南医科大学附属中医医院制剂室提供，批号为20151201；水合氯醛：国药集团化学试剂有限公司，批号：141203；肝素钠注射液：成都市海通药业有限公司，批号：150709；医用碘伏消毒液：四川金山制药有限公司，批号：150101；0.9%生理盐水：四川科伦药业股份有限公司，批号：B1510908；过氧化氢溶液：国药集团化学试剂有限公司，批号：10011208；伊文思蓝：上海医药集团上海试剂公司，批号：20150104；甲酰胺：重庆东方红试剂厂，批号：140918。

1.3 实验仪器大鼠脑立体定位仪：安徽正华生物仪器设备有限公司；ATPB457A小动物电子称：深圳安普特电子科技有限公司；AUY220精密电子天平：日本岛津公司；UPH-II-10T超纯水机：南京优普环保设备有限公司；GR60DR全自动高压灭菌器：厦门致微公司；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱：苏州江东精密仪器有限公司；电子恒温三用水箱：北京亿百川科技发展有限公司；Model 680酶标仪：美国Bio-Rad；ANKE TGL-16B高速台式离心机：上海安亭科学仪器厂；IMS-40全自动雪花制冰机：常熟雪珂电器有限责任公司；JEM-1400电子显微镜：日本电子株式会社；Leica热膨胀式超薄切片机：河南荣程联合科技有限公司。

1.4 动物造模及模型评估大鼠术前禁食12h，称重麻醉后断尾取尾部自体血50μl。将大鼠用立体定位仪俯卧位固定，备皮消毒，暴露手术区域，沿头皮正中纵行切开约10mm，用30%双氧水腐蚀骨膜，参照的Rosenber[3]的方法，并根据《大鼠脑立体定位图谱》[4]进行尾壳核定位(矢状缝右侧旁开3.0mm，前囟前0.2mm处)，用微量进样器按5μl/min的速度缓慢匀速注入自体血后，留针15分钟缓慢退针，骨蜡封闭颅骨，缝合头皮。假手术组只进针，不注血。参照Zea Longa[5]“5分制法”对大鼠进行神经功能缺损评分。以评分为1～3 分认为造模成功，0分则认为造模失败，4分和死亡大鼠均被剔除实验并根据分组进行相应补充。假手术组大鼠在术后清醒后无明显神经功能缺损症状，评分为0分。

1.5 动物分组及给药将195只SD大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、蛭龙活血通瘀低、中、高剂量组(分别简称为“ZL低剂量组”、“ZL中剂量组”、“ZL高剂量组”)，每组39只。并按指标检测的时间划分为12h、48h、72h三个亚组，每亚组13只。大鼠麻醉自然苏醒后进行灌胃。各药物组均给予蛭龙活血通瘀胶囊药物的等体积和相应的浓度进行灌胃。蛭龙活血通瘀胶囊成人的临床用药量为3.6g/d，按照人体用量的5倍、10倍、20倍定为低、中、高剂量。成人体质量按60kg计算，换算成各药物组大鼠的每日用药量，分别为0.3g/kg/d、0.6g/kg/d、1.2g/kg/d。大鼠的灌胃体积为3ml/次，给药次数为1次/日。模型组、假手术组给予同药物组等体积(3ml/次)的生理盐水灌胃，给药次数同药物组。

1.6 观察指标

1.6.1 脑组织含水量大鼠称重麻醉后快速断头取脑，去除软脑膜及表面血液，切取双侧大脑半球组织置于电子天平称重后，切取右侧大脑组织称得出血侧脑湿质量，再将其移入恒温鼓风干燥箱以110℃ 24h烘干至恒重，置于电子天平称得出血侧脑组织干质量。脑组织含水量(BWC)及脑系数计算公式为[6]：脑组织含水量(%)=(湿质量-干质量)/湿质量×100%；脑系数(%)=全脑质量/体质量×100%。

1.6.2 血脑屏障超微结构样本经2.5%戊二醛溶液固定，0.01M磷酸缓冲液漂洗，1%锇酸固定，蒸馏水漂洗，50%丙酮脱水，环氧丙烷置换，渗透包埋，用Leica热膨胀式超薄切片机切片，厚度为60nm；切片经枸橼酸铅双染色后，在电子显微镜下观察血脑屏障的超微结构。

1.6.3 血脑屏障通透性参照Belagev等[7]的方法，采用检测伊文思蓝(evens blue，EB)法进行测定。采样前2h，大鼠称重麻醉，经股静脉以20mg/kg注入2%伊文思蓝，2h后用0.9%生理盐水心脏灌注后断头取脑，冠状位切取针孔后脑组织称取湿质量后浸于盛有3ml甲酰胺的试管中，经电子恒温水箱45℃加热水浴24h，取上清1000rpm离心5 min，用酶标仪(波长620nm)测得光密度值(OD值)。以OD/g表示EB含量，反应血脑屏障的通透性。

2 结果

2.1 蛭龙活血通瘀胶囊对脑组织含水量的影响每组取5只比较脑组织含水量。假手术组组内在各时间点，脑含水量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较，模型组和ZL低、中、高剂量组的脑含水量均有明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，ZL低、中、高剂量组大鼠脑含水量均有明显降低，差异具有统计学意义。其中，低剂量组于12h时(P<0.05)，其余各时间点各药物组(P<0.01)。ZL各剂量组之间比较，以高剂量组为对照，低、中剂量组在12h、48h及72h具有显著性差异(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠脑组织含水量(%)比较 (只，

注：与模型组比较，1)P<0.01；与假手术组比较，2)P<0.01；与高剂量组比较，3)P<0.01

2.2 蛭龙活血通瘀胶囊对血脑屏障超微结构的影响血脑屏障由连续毛细血管内皮、内皮基膜、周细胞、周细胞基膜构成。周细胞环绕毛细血管，内皮组织间结构完整，内皮基膜及周细胞基膜完整，局部互相连接。见图1。假手术组内皮胞质厚度较均匀、表面光滑，内有少量吞饮小泡，基膜走行规则、厚薄均匀、电子密度基本一致。星形胶质细胞脚板结构清楚，其内线粒体丰富。见图2。模型组毛细血管周围水肿明显，血管与周围神经组织充满水肿液，组织稀疏，电子密度降低，血管腔形态不规则，基膜厚薄不均，内皮局部膨出，内有吞饮泡，部分与基膜剥离，血脑屏障结构破坏。见图3。ZL低剂量组血管周围局部水肿明显，血管形态不规则，内皮含较多小泡样物质，基膜的完整性破坏，周围神经胶质细胞突起较少。见图4。ZL中剂量组血管周围水肿程度降低，毛细血管腔面粗糙，局部形成结节样膨大，内皮含有较多吞饮小泡，基膜厚度不均匀，电子密度降低。见图5。ZL高剂量组血管周围水肿轻微，周细胞胞质中可见内质网与线粒体，局部水肿，内皮含较多泡样物质，基膜完整，走形规则，电子密度基本均匀。见图6。

图1 (Figure 5)×5000

图2 (Figure 6)×12000

图3 (Figure 7)×12000

图4 (Figure 8)×12000

图5 (Figure 9)×12000

图6 (Figure 10)×12000

2.3 蛭龙活血通瘀胶囊对各组大鼠血脑屏障通透性的影响每组取5只比较脑组织EB含量。假手术组在术后12h、48h、72h脑组织EB含量无明显升高，组内各时间点差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较，模型组及ZL低、中、高剂量组的脑组织EB含量均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，ZL低、中、高剂量组大鼠脑组织EB含量均有明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。ZL各剂量组之间比较，以高剂量组为对照，低、中剂量组在12h、48h及72h具有显著性差异(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠脑组织EB含量(OD/g)比较 (只，

注：与模型组比较，1)P<0.01；与假手术组比较，2)P<0.01；与高剂量组比较，3)P<0.01。

3 讨论

脑水肿是脑组织内液体过多贮积从而引起脑体积增大的一种病理状态[8]，脑水肿时由于脑内的水分增加，从而导致脑容积增大。血脑屏障(BBB)功能受损是导致血管源性脑水肿(vasogenic brain edema， VBE)的主要因素。血脑屏障(blood brain barrier，BBB)是脑与血液及脑脊液之间的一种屏障，是一个复杂的细胞系统。血脑屏障可以阻止血液中的某些物质进入脑组织，比如一些毒素和有害物质，但同时也能让营养物质和代谢产物选择性的顺利通过，以维持脑组织内环境的相对稳定，发挥其屏障作用。脑的毛细血管属于连续型毛细血管，内皮细胞之间具有紧密的连接以封闭内皮，其外有完整的基膜，并有周细胞和星型胶质细胞的突起包绕[9]。构成血脑屏障的基本组织为脑毛细血管内皮细胞(BMECs)及其间紧密连接(TJ)、内皮基膜和星型胶质细胞足突[10]。当血脑屏障功能遭到破坏，水分就在渗透压压力梯度的作用下穿过受损的血脑屏障进入脑内，出现脑水肿影响颅内压。

脑出血时血脑屏障也相应地遭到破坏，引起血脑屏障局部或广泛的通透性改变，进而引起脑组织继发性病理改变。脑出血性损伤以后各种因素综合作用引起血脑屏障的通透性增高，脑组织内环境紊乱，血脑屏障遭到破坏，功能障碍，产生并加重脑水肿形成，主要与血管源性脑水肿有关。伊文思蓝(Evens blue，EB)是一种偶氮基荧光染料，具有与体内外血清蛋白结合的特性，从而被广泛应用于评价血脑屏障的通透性，通过可见的蓝染区域和荧光显微镜下出现的红色荧光可以定性反应血脑屏障的通透性，并可采用荧光分析定量检测血管外的EB含量，目前被公认为是一种精确反应血脑屏障通透性的方法[11,12]。

本研究表明，自体血制备的脑出血大鼠在术后72h内脑含水量逐渐升高，脑水肿程度呈进行性加重的趋势，蛭龙活血通瘀胶囊能够明显降低脑出血大鼠脑组织含水量。脑出血模型大鼠在术后12h血脑屏障的通透性即可发现有明显改变，脑组织EB含量明显升高，术后48h时升高最为明显，72h时较之稍有下降。电镜超微结构显示术后48h，整个血管腔形态不规则，基膜厚薄不均，毛细血管周围水肿明显，组织稀疏，电子密度降低，内皮局部膨出，部分与基膜剥离，血脑屏障结构发生破坏。当给予蛭龙活血通瘀胶囊低、中、高剂量进行药物干预治疗后，在术后12h、48h及72h，大鼠血脑屏障通透性较模型组均具有不同程度的改善，脑组织EB含量较之有所下降，电镜超微结构观察发现血管周围水肿程度较为轻微，血脑屏障的结构相对完整。说明蛭龙活血通瘀胶囊对脑出血大鼠血脑屏障功能具有明显的改善作用。

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四川省科技厅分阶段中医药干预脑出血急性期优化方案研究(No.14ZC0036)

1．西南医科大学附属中医医院心脑病科(泸州 646000)；2.西南医科大学附属中医医院儿科(泸州 646000)

△通讯作者

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.22.019

1003-8914(2016)-22-3271-04

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2016-09-21)