miR-34a通过靶向调控Notch1表达影响乳腺癌细胞的增殖

高砚春

(川北医学院附属医院甲状腺乳腺外科，四川 南充 637000)



研究报告

miR-34a通过靶向调控Notch1表达影响乳腺癌细胞的增殖

高砚春

(川北医学院附属医院甲状腺乳腺外科，四川 南充 637000)

目的探讨miR-34a通过靶向调控Notch1表达影响乳腺癌细胞的增殖。方法乳腺癌细胞MCF-7转染miR-34a mimics及miR-34a NC，RT-PCR法检测细胞中miR-34a表达，MTT，克隆形成实验，Hoechst染色及流式细胞术分别检测miR-34a mimics对乳腺癌MCF-7细胞活力、克隆能力、凋亡情况及细胞周期的影响；通过双荧光素酶报告基因实验，western blot及RT-PCR检测Notch1是否是miR-34a的下游靶基因。结果与miR-34a NC比较，miR-34 mimics组中miR-34a表达量上调，细胞活力降低(P<0.01)，细胞凋亡率显著提高(P<0.01)，细胞克隆数目减少(P<0.01)，细胞周期阻滞在G1期(P<0.01)，Notch1蛋白及mRNA表达量都显著降低(P<0.01)，同时荧光素酶报告基因实验也证实miR-34a mimics能与报告基因结合。结论miR-34a mimics能通过负性调控Notch1表达，从而显著的抑制MCF-7乳腺癌细胞增值，并诱导细胞凋亡。

miR-34a；Notch1；乳腺癌细胞MCF-7；增殖

乳腺癌是女性较容易患的恶性肿瘤之一，是导致女性癌症死亡的第二大原因，在我国及全世界范围内发病率都呈上升趋势。尽管近年来放疗、化疗以及生物治疗技术的不断发展，使得乳腺癌患者的预后及生存期获得了很大改善，但是乳腺癌复发率及难治率仍居高不下[1]。因此寻找有效的诊断及治疗方法是乳腺癌研究一直以来的关注点。Notch是1917年美国著名遗传学家Thomas在果蝇缺口翅膀中发现并命名的，并于1980年克隆成功。Notch包括配体，受体及下游效应分子。其中受体包括4种，分别为Notch1，Notch2，Notch3，Notch4。研究显示Notch信号通路在包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤中高表达，特别是Notch1[2-3]。Notch1在乳腺癌中高表达[4]，沉默Notch1表达能显著的抑制MCF-7细胞增殖，并诱导细胞凋亡[5]。同时研究也表明Notch1的高表达与miRNA的异常表达密切相关[6-8]，从而提示miRNA可能通过调控Notch1表达从而影响肿瘤的增殖与凋亡等生物学行为。

miRNA是一类高度保守的非编码内源性RNA分子，长度大约为19-23 nt，能通过结合于其下游靶基因3′端非编码区，从而调控靶基因的转录，进而影响细胞的生物学行为。研究表明miR-34a能与Notch1报告基因结合，从而影响结肠癌SW480细胞，膀胱癌细胞T24细胞的增殖作用[7-8]。但对于在乳腺癌中miR-34a是否能够通过靶向Notch1表达从而影响MCF-7细胞的增殖还未见报道，所以本研究将对此展开研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

人乳腺癌细胞MCF-7购于中国科学院上海细胞库。

1.1.2 试剂

兔抗Notch1多克隆抗体(美国Abcam公司)；四甲基偶氮唑盐(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；小鼠抗GAPDH单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，BCA试剂盒，Hoechst 33258染色试剂盒，细胞周期检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；LipofectamineTM2000，trizol试剂盒，一步法RT-PCR试剂盒(大连宝生生物有限公司)；野生型载体pmir-RB-ReportTM Notch1 3’UTR-Wt，突变型载体pmir-RB-ReportTM 3’UTR-Mut，miR-34a mimics及miR-34a NC(广州市锐博生物科技有限公司)。

1.1.3 仪器

迷你双垂直电泳仪，迷你转印电泳仪(北京六一仪器厂)；ChemiDocTM XRS凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)；TS100倒置显微镜(日本Nikon公司)；FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)；SMA2000型微量紫外分光光度计(美国Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染

当MCF-7细胞汇合度达到50%左右时候，利用LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒分别转染miR34a NC、miR-34a mimics，6 h以后换成含10%血清的DMEM培养基；37℃，CO2培养箱培养48 h。应用RT-PCR检测细胞中miR-34a的表达。

12.2 MTT法检测细胞活力

将MCF-7细胞接种于96孔板，按“1.2.1”进行转染。48 h后，加入20 μL终浓度为5 mg/mL的MTT，继续培养4 h后，将上清液舍弃，并每孔加入150 μL的二甲基亚砜，震荡使结晶物充分溶解，于酶标仪560 nm处测OD值，OD值即代表细胞活力。

1.2.3 集落形成实验

将MCF-7细胞接种于96孔板，按“1.2.1”进行转染，48 h后，用含10%甲醛和0.1%结晶紫染液固定染色，室温中放置30 min。轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分，然后拍照分析。

1.2.4 Hoechst染色检测细胞凋亡

将MCF-7细胞接种于6孔板，按“1.2.1”进行转染。48 h后用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集细胞，后按照Hoechst 33258染色试剂盒说明书进行操作，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次，加入Hoechst 33258染色液避光染色15 min，PBS洗涤3次，在荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.5 流式细胞术检测细胞周期

将MCF-7细胞接种于6孔板，按“1.2.1”进行转染。48 h后，按细胞周期检测试剂盒说明书进行检测：用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，离心，并重悬，接着加入5 μL终浓度为10 mg/mL 的Rnase，37℃孵育1 h，再加入 碘化丙啶染液，室温下避光染色 30 min，用流式细胞仪进行细胞周期检测分析。

1.2.6 RT-PCR检测细胞中miR-34a及Notch1 mRNA表达

参考Trizol试剂盒使用说明书提取总RNA，并用微量紫外分光光度计检测RNA的纯度，通过一步法RT-PCR试剂盒将逆转录RNA，并进行PCR扩增，最后将扩增产物用于2%的琼脂糖胶电泳。引物如下，Notch1上游引物：5′-GTCAACGCCGTAGA TGACCT-3′，下游引物：5′-TCTCCTCCCTGTTGTTC TGC-3′；GADPH上游引物：5′-AGCCACATCGCTC AGACA-3′，下游引物：5′-TGGACTCCACGACGTACT-3′。引物分别加入25 μL PCR反应体系中，反应条件为94℃变性45 s，59℃复性45 s，72℃延伸60 s，共35个循环。

1.2.7 Western blot检测细胞中Notch1蛋白表达

将MCF-7细胞接种于6孔板，按“1.2.1”进行转染，48 h收集细胞，加入细胞裂解液，裂解30 min后，4℃，10000 r/min离心10 min，吸取上清，即可获得总蛋白。采用BCA试剂盒检测蛋白浓度。蛋白变性，上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳，后湿法转膜30 min。将膜浸入一抗溶液(兔抗Notch1多克隆抗体，小鼠抗GAPDH单克隆抗体，稀释比例：1:100)孵育，4℃过夜；次日二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，稀释比例：1:200)室温孵育1 h。并在膜上滴加ECL曝光液，于凝胶成像系统中曝光。用“Quantity one”软件分析各抗体条带灰度值。

1.2.8 荧光素酶报告基因表达分析

miR-34a及Notch1重组载体共转染到MCF-7细胞中。分组如下：miR-34a mimics+Wt Notch1，miR-34a NC+ Wt Notch1，miR-34a mimics+Mut Notch1，miR-34a NC+ Mut Notch1。应用双荧光素酶检测系统检测转染好的荧光素酶活性，计算公式：相对荧光值=萤火虫荧光素梅荧光值/海肾荧光素梅荧光值。

1.2.9 统计学分析

2 结果

2.1 miR-34a转染效果的检测

如图1所示，与miR-34a组比较，miR-34a mimics组中miR-34a表达量显著提高，差异具有统计学意义(P<0.01)。

注：与miR-34a NC组比较，**P<0.01。

2.2 miR-34a mimics对MCF-7细胞活力及克隆数目的影响

注：与miR-34a NC组比较，**P<0.01。

注：与miR-34a NC组比较，**P<0.01。

如图2 MTT结果所示，与miR-34a NC组比较，miR-34a mimics组中细胞活力显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。如图3细胞克隆实验结果所示，与miR-34a NC组(128.57±10.69)比较，miR-34a mimics组(34.59±3.46)中细胞克隆数目显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.3 miR-34a mimics对MCF-7细胞周期的影响

如图4 流式细胞术结果所示，与miR-34a NC组比较，miR-34a mimics组中细胞周期G1期显著延长，S及G2期缩短，差异具有统计学意义(P<0.01)，说明miR-34a mimics能使细胞周期显著阻滞在G1期。

图4 miR-34a mimics对MCF-7细胞周期的影响Fig.4 Effect of miR-34a mimics on MCF-7 cell viability

表1 miR-34a mimics对MCF-7细胞周期的影响Tab.1 Effect of miR-34a mimics on MCF-7 cell viability

2.4 miR-34a mimics对MCF-7细胞凋亡情况的影响

如图5 Hoecsht染色结果所示，与miR-34a NC组(3.56±0.36)比较，miR-34a mimics组(36.48±3.65)细胞凋亡率显著提高，差异具统计学意义(P<0.01)。

图5 miR-34a mimics对MCF-7细胞凋亡情况的影响(×20)Fig.5 Effect of miR-34a mimics on MCF-7cell apoptosis (×20)

2.4 荧光素酶报告基因表达分析

将miR-34a mimics、miR-34a NC及野生型载体pmir-RB-ReportTM Notch1 3’UTR-Wt、及突变型载体pmir-RB-ReportTM Notch1 3’UTR-Mut转入MCF-7细胞中，结果发现，miR-34a mimics与野生型载体pmir-RB-ReportTM Notch1 3’UTR-Wt共转染组的荧光信号强度明显弱于其它转染组，差异具有统计学意义(P<0.01)。而对于突变型载体pmir-RB-ReportTM Notch1 3’UTR-Mut来说，各组间荧光强度无任何差别(P>0.05)，说明Notch1是miR-34a下游靶基因(图6)。

注：与miR-34a NC组比较，**P<0.01。

2.5 miR-34a mimics对MCF-7细胞中Notch1蛋白及mRNA表达量的影响

如图7所示，与miR-34a NC组比较，miR-34a mimics组中Notch1蛋白及mRNA表达量显著降低(P<0.05)。

注：与miR-34a NC组比较，**P<0.01。

3 讨论

miRNA具有癌基因或抑癌基因的作用，能够结合于靶基因mRNA的3’-UTR区域，阻遏靶基因的翻译，从而抑制靶基因表达，并与肿瘤的发生发展密切相关，在肿瘤的增殖，凋亡，侵袭转移中起重要作用[9-10]。miR-34家族是一类高度保守的miRNA，广泛存在于节肢动物及哺乳动物中，包括三个同源基因，即miR-34a，miR-34b，miR-34c。其中miR-34a是miR-34基因突变的结果，染色体定位于1p36.23，且能够广泛存在肺以外的所有正常组织中，而miR-34b及miR-34c是miR-34串联形成的，在肺以外的正常组织中表达量有限[11]。研究认为miR-34家族是具有抑癌作用的miRNA，miR-34家族在包括乳腺癌在内的大多数肿瘤组织中低表达，特别是miR-34a，miR-34a的异常表达可作为乳腺癌患者患瘤风险，诊断，预后的标志[11]。而且miR-34a表达量上调后对膀胱癌细胞，结肠癌细胞的增殖具有显著的影响[7-8]。因此我们推测miR-34a对乳腺癌细胞的增殖凋亡等生物学行为也具有显著的影响作用，所以本研究在此推论上，首先通过脂质体转染miR-34a mimics及miR-34a NC，RT-PCR检测转染后MCF-7细胞中miR-34a的表达，结果表明miR-34 mimics转染成功，接着通过MTT法及克隆实验证实了miR-34a mimics能显著的降低MCF-7细胞活力及细胞克隆数目，说明miR-34a mimics对MCF细胞增殖具有显著的抑制作用。Hoechst染色结果也证实了结论，也与Nie等[12]，Zhao等[13]研究miR-34a mimics在食管鳞状细胞癌细胞，骨肉瘤细胞中的作用一致。另外肿瘤细胞的恶性增殖，说明了肿瘤细胞周期的紊乱及不可控，且大多数抗癌药物也通过调控细胞周期的变化来发挥其疗效的，所以本研究接着采用流式细胞术检测miR-34a mimics对MCF-7细胞周期的影响，结果表明miR-34a mimics能延长MCF-7细胞周期，使细胞周期阻滞在G1期，并缩短G2和M期，从而阻断了细胞的有丝分裂及DNA复制，进一步的说明了miR-34a mimics对MCF细胞增殖的抑制作用，与Ghawanmeh等[14]研究观点一致。

miRNA对细胞生物学行为的调控作用基本都是基于其对下游靶基因的调控作用，miR-34a也不例外。有学者通过生物软件预测发现Notch1可能是miR-34a的下游靶基因之一，且此基因与细胞增殖密切相关[7, 8]。Notch1是1991年在人类T淋巴细胞白血病中被鉴定出来，并被证实与肿瘤的发生发展密切相关。Norch1是由RAM结构区，6个与细胞周期相关的重复区，2个细胞核定位信号，富含谷氨酸区及PEST序列构成的。研究显示Notch1与肿瘤的生长，分化，凋亡密切相关[15]。而且本研究的双荧光素酶报告基因实验证实了miR-34a mimics能显著的与Notch1的3’端结合，接着western blot及RT-PCR也证实了较miR-34a NC比较，miR-34a mimics组中Notch1蛋白及mRNA表达量均显著下调，从而说明了Notch1是miR-34a的下游靶基因，而且干扰Notch1表达能显著的抑制MCF-7增殖[5]，进而得出miR-34a mimics通过靶向下调Notch1表达，从而抑制MCF细胞的增殖。

综上所述，miR-34a mimics能通过靶向负调控Notch1表达，诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡，并抑制细胞增殖，使细胞周期阻滞在G1期。此外研究还证实p53基因能与miR-34a启动子结合，从而激活miR-34a的转录，而在肿瘤组织中p53发生突变，导致miR-34a的转录受到抑制，呈低表达状态[16]。而且另有大量研究表明p53与Notch1之间也存在着直接的联系[17]。从而提示了MCF-7细胞中miR-34a对于Notch1的调控作用可能与p53信号通路有关，将是本课题组将来的研究方向。

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Inhibitory effect of miR-34a on the proliferation of breast cancer cell by targeting Notch1

GAO Yan-chun

(Department of thyroid and breast surgery of the Affiliated Hospital of Chuanbei Medical College,Sichuan Nanchong, 637000, China)

Objective To explore inhibitory effect of miR-34a on the proliferation of breast cancer cell MCF-7 by targeting Notch1. Methods MCF-7 cells were transferred with miR-34a mimics and miR-34a NC. The expression of miR-34a in MCF-7 cell was examed by RT-PCR. The cell viability was detected by MTT. The cell apoptosis was examed by Hoechst staining. Cell cycle was detected by flow cytometry. Western blot, RT-PCR and dual luciferase reporter gene assay was to detect whether Notch1 was a downstream target gene of miR-34a. Results Compared with miR-34a NC group, the expression of miR-34a was up-regulated, the cell viability was decreased, cell apoptotic rate was increased, cell cycle was arrested in the G1 phase, the expression of Notch1 protein and mRNA was down-regulated (P<0.01). Conclusion miR-34a mimics inhibited MCF-7 cell proliferation and induced cell apoptosis via targeting regulation expression of Notch1.

miR-34a; Notch1; breast cancer cell MCF-7; proliferation

高砚春(1976-)，女，硕士，副主任医师，研究方向：乳腺癌综合治疗。E-mail： 164771624@qq.com。

R-332

A

1671-7856(2016)11-0055-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.11.010

2016-07-28