帕金森病患者外周血Th17/Treg平衡及相关细胞因子水平测定及意义

姜立刚， 慕振兴， 孙博谦



帕金森病患者外周血Th17/Treg平衡及相关细胞因子水平测定及意义

姜立刚， 慕振兴， 孙博谦

目的 探讨帕金森病(PD)患者外周血Th17/Treg平衡及相关细胞因子含量变化的意义。方法 收集50例PD患者(PD组)及50例健康体检者(Control组)，采集所有研究对象外周血。采用流式细胞仪检测外周血中Th17细胞及Treg细胞含量；采用ELISA检测血浆中细胞因子TGF-β、IL-6和IL-17水平。结果 流式细胞计数结果显示，PD组的外周血Treg细胞和Th17细胞水平较Control组均显著增加(P均<0.01)，Treg细胞的增长程度明显大于大于Th17细胞，同时PD组Treg/Th17细胞比较Control组也明显增加(P均<0.01)。ELISA检测结果显示，与Control组相比，PD组的血浆TGF-β1、IL-6及IL-17含量均有显著增加(P均<0.01)。结论 PD患者的外周血Treg/Th17平衡存在失衡，提示PD病理过程可能与其外周血Treg/Th17失衡有关。

帕金森病； Th17细胞； Treg细胞； TGF-β1； IL-6

帕金森病(PD)是一种由大脑黑质多巴胺神经元减少及脑区域α-突出核蛋白沉淀引起的神经退化性疾病，脑黑质神经元缺少导致纹状体多巴胺的减少并出现一些运动性症状如运动迟缓、僵直及震颤等[1～3]。目前PD的神经元退化机制尚未研究透彻，可能涉及α-突出核蛋白聚集、氧化应激、线粒体复合物I活性缺失、铁含量增加及蛋白质加工程序的改变等，而根据近年来流行病学和遗传学的研究，PD的进展也和神经炎症过程存在相关性[4，5]。炎症反应通常与免疫反应有关，Th17细胞及Treg细胞作为重要的T细胞亚型，在机体的免疫反应中具有重要的调节作用，Th17细胞能够分泌多种细胞因子，具有增强和促进炎症反应的作用，与Treg细胞的生理功能相互拮抗，因此当机体发生炎症等问题时，Th17/Treg细胞平衡比例将会发生变化[6～8]。这些研究结果提示引起帕金森病的神经炎症反应可能也会导致血清中Th17/Treg细胞平衡比例发生变化，然而在目前的研究中，尚未见有关PD患者血清中Th17/Treg细胞平衡比例变化的报道。本文研究了50例PD患者及50例健康体检者，分别比较两组志愿者外周血Th17/Treg细胞比例差异，并检测血清中相关细胞因子如TGF-β1、IL-6表达水平，探讨血清中Th17/Treg比例及相关细胞因子如TGF-β1、IL-6在PD发生发展过程中的意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料 RPMI 1640培养基购自美国Thermo Scientific公司；胎牛血清购自美国Life Technologies公司；佛波酯PMA、离子霉素、莫能菌素、抗人IL-17A的FITC标记的单抗、抗人CD127的PE标记单抗购自美国eBioscience公司；抗人CD3的PE-cy5标记单抗、抗人CD8的PE标记单抗、抗人CD4的FITC标记单抗及抗人CD25的PE-cy5标记单抗购自美国Beckman Coulter公司；红细胞裂解液购自美国Invitrogen公司；TGF-β1及IL-6 ELISA检测试剂盒购自美国Market公司；流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司；全波长酶标仪购自美国Thermo Scientific公司。

1.2 病例选择 于2011～2015年期间收集北华大学附属医院50例PD患者(PD组)及50例健康体检者(Control组)，患者年龄40～74岁，平均58.6±12.7岁，患病年龄36～69岁，平均54.1±12.2岁，病程1～10 y ， 平均4.48±5.62 y，健康体检者年龄41～76岁，平均57.1±15.3岁。PD组和Control组中所有研究对象均抽取10 ml外周静脉血。本研究在所有研究对象完全知情的情况下进行，并经伦理委员会批准。

1.3 细胞及样品准备 获取外周血后将血细胞和血浆分离，血浆储存于-80 ℃，用于检测血浆中细胞因子TGF-β1和IL-6浓度，采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心(室温条件下3000 r/min离心10 min)分离单核血细胞。单核细胞采用RPMI 1640培养基(加入10%胎牛血清)重悬并使细胞密度保持每毫升2×106个/细胞。

1.4 流式细胞计数 Th17细胞采用的是CD3阳性表达、CD8阴性表达且IL-17阳性表达的T细胞，其染色步骤如下，在1.7 μg/ml莫能菌素存在下，于六孔板中加入25 ng/ml佛波酯PMA和1 μg/ml离子霉素刺激Th17细胞悬浮液，在37 ℃、5% CO2条件下培养5 h。将细胞转移至管子中，采用PBS洗涤一次后加入10 μI抗人CD3的PE-cy5标记单抗和20 μl抗人CD8的PE标记单抗，在室温条件下孵育15 min。按照说明书采用抗人IL-17A的FITC标记的单抗对细胞进行染色。Treg细胞采用的是CD4、CD25高表达及CD127低表达的T细胞，其染色步骤如下，将20 μI抗人CD127的PE标记单抗、20 μI抗人CD4的FITC标记单抗及10 μI抗人CD25的PE-cy5标记单抗加入到Treg细胞中室温孵育20 min，加入2 ml红细胞裂解缓冲液继续孵育20 min。同型的对照用于非特异性结合的校正，Th17细胞和Treg细胞分别采用流式细胞仪进行分析。

1.5 ELISA检测 血浆中细胞因子TGF-β、IL-6和IL-17水平采用ELISA试剂盒检测，具体操作按照说明书进行，450 nm出的吸收值采用全波长酶标仪进行检测。

2 结 果

2.1 外周血Th17细胞及Treg细胞含量检测 为检测PD组及Control组外周血中Treg细胞和Th17细胞水平，在荧光抗体标记两种细胞后采用流式细胞仪分别对Treg细胞和Th17细胞进行计数，结果见表1及图1所示，PD组和Control组的Treg细胞水平为6.57%±0.821%和2.31%±0.412%、Th17细胞为2.32%±0.469%和1.27%±0.328%、Treg/Th17细胞比为2.83±0.437及1.82±0.312。结果显示，与Control组相比，PD组的外周血Treg细胞和Th17细胞水平均显著增加(P均<0.01)，Treg细胞的增长程度明显大于大于Th17细胞，同时PD组Treg/Th17细胞比也明显增加(P均<0.01)。

2.2 血浆TGF-β1、IL-6及IL-17水平检测 为考察PD组及Control组血浆中细胞因子TGF-β、IL-6和IL-17含量差异，采用ELISA法分别进行检测，检测结果见表2及图2所示，PD组和Control组的TGF-β1含量为130±21.1 pg/ml及32.3±17.4 pg/ml、IL-6含量为42.3±7.32 pg/ml及21.4±6.47 pg/ml、IL-17含量为121±13.2 pg/ml及81.3±12.7 pg/ml。结果显示，与Control组相比，PD组的血浆TGF-β1、IL-6及IL-17含量均有显著增加(P均<0.01)。

表1 外周血Treg细胞、Th17细胞及Treg/Th17水平

表2 血浆TGF-β1、IL-6及IL-17水平检测(pg/ml)

A、B、C分别代表外周血Th17细胞、Treg细胞及Treg/Th17水平，数据采用Mann-Whitney U检验分析

A、B、C分别代表血浆TGF-β1、IL-6及IL-17水平(pg/ml)，数据采用Mann-Whitney U检验分析

3 讨 论

炎症反应能够刺激机体产生炎症介质，从而是机体产生强烈的促炎和抗炎反应，进而使机体免疫功能产生异常。很多研究显示，在机体免疫系统中，Treg细胞及Th17细胞在调节机体免疫功能过程中具有很重要的作用，两种细胞通过多种途径参与免疫功能调节，其相对水平相对稳定，使机体免疫功能达到稳定健康的状态，而一旦机体发生炎症反应，则机体内Treg细胞和Th17细胞比例将发生变化[9～12]，因此在研究炎症反应中，对Treg细胞和Th17细胞比例进行检测是一项比较有效的方式。近年来多项研究显示，神经炎症与多种神经退化性疾病如帕金森病、阿尔茨海默病、亨利顿病等存在相关性[13，14]，因此PD患者外周血中Treg细胞和Th17细胞比例很可能会因为神经炎症而发生变化。

Th17细胞具有多种功能，能够分泌IL-17，并诱导分泌IL-6等多种细胞因子，其中细胞因子IL-17是强致炎因子，因此在炎症的发展过程中该细胞扮演重要的角色[15]。有研究显示，在具有炎症反应的机体外周血和组织中均发现Th17细胞和IL-17含量的显著增加，这些发现提示在炎症反应中的免疫应答与Th17细胞和IL-17存在很重要的关系[16]。本研究中，与Control组相比，PD组的Th17细胞含量均有显著性增加(P均<0.01)，这一结果也提示Th17细胞与PD的发展存在相关性，并且这一结果与PD组血浆IL-17(P<0.01)相一致。

Treg细胞能够分泌可溶性的细胞因子TGF-β1及IL-10等，其主要功能是通过下调自身免疫应答来调节免疫应答与T细胞在炎症反应等过程中对抗原应答的平衡[17]。在炎症反应过程中，Treg细胞含量会发生变化，研究显示，机体在病毒感染引发炎症时血清和组织Treg细胞数会显著增加，Treg细胞增加能够抑制T细胞的应答[18]。本研究中，我们发现与Control组相比，PD组患者外周血中Treg细胞含量显著增加(P均<0.01)，且血浆中TGF-β1含量也有显著性增加(P均<0.01)，这说明PD与Treg细胞的功能也存在相关性。

机体中Treg细胞与Th17细胞分别具有抑制和促进炎症反应的功能，这一对生理功能相互拮抗的细胞含量比例(Treg/Th17)平衡在机体正常免疫功能的发挥中具有重要的作用[19]，通常情况下其指数在1.5～2.5之间，在多种免疫性疾病发生发展过程中，都会出现Treg/Th17平衡变化，因此Treg/Th17平衡可以作为多种免疫性疾病包括炎症反应的一个主要指标。在本研究中，较Control组，PD组外周血Treg细胞与Th17细胞含量均出现了显著性增加(P均<0.01)，其中Treg细胞含量增加则更为显著，这导致了平衡发生变化，使PD组的Treg/Th17显著高于Control组(P<0.01)，这指示PD患者Treg/Th17平衡失调。

强致炎细胞因子IL-17具有促进肿瘤坏死因子α(TNFα)及IL-6分泌的作用，而IL-6又能够催化Th17细胞的形成，因此，Th17细胞、IL-17及IL-6含量的增加是具有因果性的。根据本研究结果，与Control组相比，PD组血浆IL-6水平也有显著性增加(P<0.01)，这指示Th17细胞含量增加，也预示着在IL-6的催化促进下Th17细胞含量将进一步增加。另外本研究结果还显示，PD组血浆TGF-β1含量也显著增加，由于该细胞因子具有促进Treg细胞分泌更多的细胞因子，因而该细胞因子含量增加也将加重Treg/Th17平衡失调[20]。虽然细胞因子IL-6和TGF-β1水平均增加，但是显然TGF-β1水平增加更为显著，这提示TGF-β1促进Treg细胞含量增加将更显著。

本文通过研究PD患者与健康体检者外周血Treg/Th17平衡变化及血浆细胞因子TGF-β1、IL-6和IL-17水平变化情况，发现PD患者的外周血Treg/Th17平衡失衡，且与免疫相关的细胞因子TGF-β1、IL-6和IL-17在血浆中含量也均存在不同程度的增加。机体外周血Treg/Th17平衡失调显示机体免疫机能的异常，而相关细胞因子TGF-β1、IL-6和IL-17含量的变化不仅印证了外周血Treg/Th17平衡失调结果，也提示了PD病理过程中机体免疫功能的异常。

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The significance of Treg/Th17 balance and the associated cytokines in the peripheral blood of Parkinson’s disease

JIANG Ligang，MU Zhenxing，SUN Boqian.

(Department of Neurology，Affiliated Hospital of Beihua University，Jilin 132013，China)

Objective To explore the roles of Treg/Th17 and the associated cytokines in the peripheral blood of Parkinson’s disease (PD) patients. Method The Blood blood samples were obtained from 50 PD patients (PD group) and 50 healthy volunteers (Control group). The percentage of Treg cells and Th17 cells were assessed by flow cytometry，respectively. The levels of TGF-β1，IL-6 and IL-17 of the plasma were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Result The frequencies of Treg and Th17 cells were significantly increased in the peripheral blood of PD patients(P<0.01)，but the increase of Treg cells was less than that of Th17 cells，which led to an increased ratio of Treg/Th17 cells. The plasma levels of TGF-β1，IL-6 and IL-17 were significantly increased in PD group (P<0.01). Conclusion The imbalance of Treg/Th17 exists in the peripheral blood of PD patients，and this suggests that the imbalance of Treg/Th17 may be associated with the PD.

Parkinson’s disease； Th17 cell； Treg cell； TGF-β1； IL-6

1003-2754(2016)03-0222-04

2016-01-29；

2016-03-06

吉林省科技厅青年科研基金项目(No. 20130522026JH)

(北华大学附属医院神经内科，吉林 吉林 132013)

孙博谦，E-mail：beihua78726@163.com

R742.5

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