人体宫颈上皮细胞的体外培养及鉴定

芮 瑞，洪 颖

(1.南京医科大学附属逸夫医院，江苏 南京 211100；2.南京大学附属鼓楼医院，江苏 南京 210000)



【女性生殖健康研究】

人体宫颈上皮细胞的体外培养及鉴定

芮 瑞1，洪 颖2

(1.南京医科大学附属逸夫医院，江苏 南京 211100；2.南京大学附属鼓楼医院，江苏 南京 210000)

随着宫颈癌及癌前期疾病发病率的增加，人们对其发病机制的的研究也越来越深入。自对人宫颈癌细胞体外培养获得成功后，学者对不同类型的宫颈细胞的体外培养实验也相继展开研究。通过对宫颈上皮细胞特定角蛋白及免疫标记物的测定来鉴定是否为宫颈细胞，通过观察培养出的各类型宫颈细胞的生物学特性是进一步研究宫颈疾病发生发展规律从而找出治疗宫颈疾病的最佳途径。

人体宫颈上皮细胞；宫颈疾病；体外培养；鉴定

宫颈癌是严重威胁女性生殖健康的恶性疾病，美国妇产科医师协会在2016年发布的第157号宫颈癌筛查指南中提出宫颈癌的发病率位居女性生殖系统恶性肿瘤的第一位。近年来对于宫颈癌的研究有以下三方面的成果：①早在1999年，Walboomers 等提出导致宫颈癌发生的根本原因是人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的感染。随后在2002年Zur Hausen指出高危型人乳头瘤病毒对人宫颈的持续感染是宫颈上皮内病变及宫颈癌发生的必要条件；②由于各种宫颈癌筛查方法的问世及有效开展，宫颈HPV的检出率显著提升，宫颈高级别上皮内病变的发生率、宫颈癌发生率和死亡率均有大幅度下降；③HPV疫苗的问世给人们带来了福音，并在预防病毒感染的领域初见成效。基于以上的研究基础，各国学者纷纷开始尝试探索快速、有效并简便的培养宫颈上皮原代细胞的方法；建立相应的体外模型，研究宫颈癌及其上皮内病变的生物学特性，并试图在治疗领域发现更多的方法。

所谓原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。原代培养离体时间短，其遗传性状和体内的细胞相似，适合做细胞形态、功能和分化等的研究。目前报道的宫颈上皮原代细胞培养分为3个类别：正常宫颈上皮细胞(normal cervical epithelial cell，NCC)培养、高级别宫颈上皮内病变细胞(high-grade cervical intraepithelial lesion cells，HSIL)培养及宫颈癌细胞(cervical cancer cell)培养。

1正常宫颈上皮细胞培养及鉴定

1.1概述

正常宫颈上皮细胞培养是指显微镜下细胞形态无病理改变。子宫颈上皮由宫颈阴道部的鳞状上皮和宫颈管柱状上皮组成。鳞状上皮由深至浅可分为基底带、中层带和浅表带3个带。基底带由无明显细胞增殖表现的基底细胞和增生活跃的旁基底细胞构成。基底细胞为储备细胞，无明显细胞增殖表现，在某些因素刺激下可以增生成为不典型鳞状细胞或分化为成熟鳞状细胞。旁基底细胞为增生活跃的细胞，偶见分裂象。中间带与浅表带为完全不增生的细胞，称为成熟细胞。由于浅层的宫颈上皮细胞均为完全不增生的成熟细胞，很难培养成功，因此相应的文献报道很少[1]。根据文献，国内外很多学者使用胎儿宫颈上皮细胞进行培养，但由于与成人宫颈细胞的生物学特性存在差异，因而对细胞体外模型的研究受到限制。所以，很多学者想到使用有HPV感染的宫颈上皮细胞进行培养。病毒感染后细胞处于分裂增殖状态，易于在体外培养成功。1989年英国剑桥大学的Stanley、1991年美国西北大学的Mary 分别报道了W12、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)-612两种研究最为成熟的带病毒的细胞株，为研究HPV感染的特性提供模型。也有研究表明宫颈HPV-DNA阴性的供应组织也可以进行体外细胞培养[2]。

1.2早期宫颈细胞培养方法

宫颈上皮细胞的培养分为组织块培养与细胞培养，Freshney等在2002年提出细胞培养法又分为借助丝裂霉素处理的消化直接培养法与钴源照射后的小鼠成纤维细胞-3T3饲养层细胞培养法两种。早期多采用组织块法培养，由于上皮细胞贴壁困难且混有成纤维细胞以致很难培养出数量多、纯度高的宫颈上皮细胞。1977年，Rheinwald和Green在Nature杂志上公开发表了在新生儿包皮角化上皮细胞培养过程中加入表皮生长因子及霍乱毒素可以延迟细胞分化并促进克隆细胞形成，使得角质细胞可以在体外进行分离和培养。该研究将人们的思路转移到关注细胞培养基的改进中去，同时促进了细胞体外培养技术的发展。目前通用的宫颈上皮细胞培养方法是在细胞培养基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)中添加氢化可的松和霍乱毒素，借助3T3细胞饲养层，培养宫颈上皮细胞。该方法细胞贴壁及生长较快，并可促进细胞分化。众所周知，上皮细胞在有正常浓度(10%)血清的培养基中培养时，成纤维细胞的生长速度超过了所培养的细胞，抑制了上皮细胞的生长，因此有人尝试使用无血清培养基如角朊细胞无血清培养基(keratin cells in serum free medium，K-SFM)或角朊细胞生长培养基(keratin cell growth medium，KGM)培养宫颈细胞。由于成纤维细胞该培在养基中无法很好地生长，因此培养出的上皮细胞纯度较高，但细胞的贴壁生长较慢。Ian Freshney等在2002年的研究中发现，如果不利用其它介质，很难在无血清培养基中培养出理想的细胞。国内江静等(2014年)研究却发现上皮细胞在专用无血清培养基中不能生长[2]，但Stanley 等在2002年的研究中认为，血清包被的培养瓶可以促进细胞的贴壁。基于以上两种观点，不同培养基的选择开始成为人们研究细胞培养的热点问题。

1.3近期宫颈细胞培养方法

近期报道的宫颈上皮细胞培养中，均选取因子宫肌瘤或子宫腺肌瘤等良性病变行全子宫切除，且宫颈细胞学检查阴性者的宫颈组织。培养方法：①将组织处理后置入K-SFM培养基中，使用diapase II酶将宫颈上皮层与真皮层分离，取上皮组织采用胰蛋白酶消化法，得到细胞悬液，弃上清后加入K-SFM培养基中培养，所得到人宫颈上皮细胞数量多、纯度高；②采用Ⅰ型胶原酶分解宫颈上皮，置入含低浓度(5%)胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的无血清培养基中培养，转至鼠胶原包被的培养瓶中[2]，也得到了易贴壁、纯度高的宫颈细胞；③使用diapase Ⅱ酶及胰酶联合消化后得到细胞悬液，弃上清，加入K-SFM培养基，再转至FBS包被的培养瓶，另加入DMEM或1640培养基中培养。结果发现加入K-SFM培养基+含FBS培养瓶培养的成功率高于DMEM或1640培养基。

1.4宫颈上皮细胞鉴定

一般对培养出的宫颈细胞采取免疫组织化学和细胞免疫荧光的方法来证实其为宫颈上皮细胞。在上述培养方法①中，进行细胞免疫组化染色，发现细胞角蛋白(keratin，K)阳性率(见图1和图2)与波形蛋白(vimentin)阴性率均高于90%。方法②中采用测定宫颈上皮基层角蛋白的方式进行鉴定。K5和K19主要表达于增生活跃的体外培养的细胞中[1]，Stanley等在2002年的研究中发现K5和K14在正常宫颈细胞中均有表达。通过免疫荧光的手段测出K5弱阳性，K14、K19阳性(见图3)[2]。方法③中行免疫组化，测鼠抗人E-钙黏蛋白(E-cadherin)阳性和波形蛋白阴性(见图4和图5)。

图1 角蛋白阳性的宫颈上皮细胞(200×)

图2 角蛋白阳性的宫颈上皮细胞(400×)

注：5A：K5弱阳性；5B：K14强阳性；5C：K19强阳性

图3 宫颈上皮角蛋白免疫荧光染色[2]

Fig.3 Immunofluorescence staining of cervical epithelial keratin

图4 原代宫颈细胞E-cadherin染色阳性(400×)

Fig.4 Primary cervical cell E-cadherin staining was positive

图5 原代宫颈细胞vimentin染色阳性 (400×)

Fig.5 Primary cervical cell vimentin staining was positive

2高级别宫颈上皮内病变细胞培养及鉴定

2.1概述

CIN是与子宫颈浸润癌密切相关的一组子宫颈病变，包括鳞状上皮和腺上皮，分为Ⅰ～Ⅲ级。其中CINⅠ为低级别宫颈上皮内病变(low-grade cervical intraepithelial lesions cells，LSIL)，约60%会自然消退。CINⅡ～Ⅲ为高级别宫颈上皮内病变(HSIL)。对CINⅡ的最新认识指出它不是CINⅠ和CINⅢ的中间类型，而似乎反映了低级别和高级别病变共同混合作用的结果[3]。在一组未经治疗的CINⅢ患者队列中，跟踪随访30年发现浸润癌累计发生率为30.1%，证明CINⅢ有进展为癌的明确风险[3]。

2.2细胞培养

在现有的文献中报道，目前对于高级别宫颈上皮内病变细胞培养的研究并不成熟。到目前为止，仅发现有为数不多的文献对CIN细胞的分离和培养进行了描述。根据文献，培养的细胞来源于宫颈上皮内病变的细胞，其中HPV的感染率较高。2002年报道的Stanley的“组织块培养法”，是对整块病变组织在显微镜下分割后放入培养瓶中进行培养，收集长出的角质细胞接种到灭活的3T3饲养层上。Coolen 等在2007年研究中指出，该方法培养出的细胞数量较多，但培养时间长，有病毒感染的潜在风险。2012年，Bononi等将宫颈上皮内病变组织用diapase Ⅱ酶消化后接种到含有10%FBS的DMEM-F12培养基中，与成纤维细胞共同培养，称之为“消化酶”法[1]。此种方法的不足之处在于过程复杂、易污染、时间长。在其文章中提出细胞的二次收集和接种是有效增加细胞贴壁率的方法[1]。Liu等[4]报道了采用鼠尾胶原包被培养瓶及低浓度浓度血清培养基(K-SFM+5%FBS)方法培养，待细胞贴壁后更换无血清培养基进行细胞纯化，其培养方法同正常宫颈细胞。消化后的CIN组织不需要使用筛网过滤，因此得到的细胞数量多于正常宫颈细胞[4]。

2.3细胞鉴定

在培养前后采用PCR(聚合酶链式反应)技术对高危型HPV进行分型检测，以判断培养出的细胞是否来源于宫颈上皮。同时采用细胞免疫荧光检测K14、K19，方法同NCC细胞。高级别CIN细胞和Hela细胞的特殊标记物K17和P63在NCC细胞中均表达阴性结果，因此很容易鉴定细胞的符合情况[6]。

3宫颈癌细胞的培养及鉴定

3.1概述

相对于前两种宫颈细胞而言，宫颈癌细胞的培养已经是一项非常成熟的技术，很多实验室都已经生产出不同类型的宫颈癌细胞株，用于宫颈癌体外模型的研究。人子宫颈癌细胞(Hela)是第一个来自人体组织经连续培养获得的非整倍体上皮样细胞系。65年前，Gey等从31岁女性黑人的宫颈癌组织建中获得建立。经原始组织切片重新观察，Jones等将其诊断为腺癌。已知该细胞系含有HPV18序列，该细胞角蛋白阳性，p53表达量较低，但表达正常水平的pRB。人子宫颈鳞癌细胞SiHa建自一个日本病人的外科手术的原位组织样品，癌基因：PRB和p53阳性。

3.2培养方法

随着科学技术的发展，各个国家都有对于宫颈癌细胞培养方法进行改进，以便探索一种简单、重复性好的培养方式。其中我国近期张璐(2012年)报道的培养方法是将宫颈癌组织经胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶消化，加入10%FBS血清的DMEM，转至培养瓶。另一种方法在上述基础上再加入15%FBS的DMEM培养基重悬细胞，后接种至培养瓶中免疫。两种方法荧光染色宫颈癌细胞表面标记物CD44、CK17表达呈阳性从而鉴定该细胞为宫颈癌细胞。根据文献报道，S期细胞比率可以作为监测一些恶性肿瘤生物学行为的有效指标，在诊断及预后中有重要的价值[5-7]。因此Liu等[4]采用流式细胞技术监测NCC细胞、CIN细胞及宫颈癌Caski细胞各DNA周期的相应指标：增殖指数(proliferative index，PI)和S期细胞比率(S-phase fraction，SPF)，最终发现可能S期细胞比率较增殖指数意义更加重要。冯定庆等(2010年)宫颈癌干细胞的培养中将消化好的宫颈癌组织置于肿瘤细胞球培养液，也就是DMEM-F12细胞培养液，也得到了很好的贴壁及传代。由于宫颈癌细胞培养技术相对成熟，实际上对于体外宫颈癌细胞生物学特性的研究多于不同培养方法的研究。胰蛋白酶与I型胶原酶联合消化的方式已经成为不同宫颈癌细胞培养的共同步骤，不同之处在于培养基的选择有些区别。

3.3鉴定

细胞黏附分子CD44和子宫颈干细胞分子标志物CK17阳性已经成为体外宫颈癌细胞的统一鉴定标准。

综上所述，根据文献，宫颈细胞培养方法的研究主要在于正常宫颈上皮细胞、HPV感染的宫颈细胞及高级别宫颈上皮内病变细胞。标本使用酶消化后接种于正常血清培养基、无血清培养基、鼠胶原包被瓶其中的一种或两种。测定细胞特定角蛋白来鉴定为宫颈细胞。而对宫颈癌细胞的培养已经成熟，使用DMEM或DMEM-F12培养基，测定CD44和CK17进行鉴定。现阶段不同类型的体外宫颈细胞培养模型建立，方便了人们了解宫颈癌发生发展的规律，为研究宫颈癌及其上皮内病变提供了理论和实验依据，若单一HPV感染宫颈细胞培养成功并能大量传代而不改变其生物学特性，则对抗HPV药物的研究起到关键的作用，同时也给基因治疗带来希望。由于减少了病患依从性差而导致的数据偏差，利于进一步研究其预防措施及分析预后，为宫颈疾病的研究及治疗提供切实可行的理论依据。

[1]Bononi I, Bosi S, Bonaccorsi G,etal. Establishment of keratinocyte colonies from small-sized cervical intraepithelial neoplasia specimens[J].J Cell Physiol,2012,227(12):3787-3795.

[2]Liu Y Z, Lü X P, Pan Z X,etal.Establishment of a novel method for primary culture of normal human cervical keratinocytes[J].Chin Med J (Engl),2013,126(17):3344-3347.

[3]American College of Obstetricians and Gynecologists.Practice Bulletin No. 157: Cervical Cancer Screening and Prevention[J].Obstet Gynecol,2016,127(1):e1-e20.

[4]Liu Y Z,Wang T T,Zhang Y Z.A modified method for the culture of naturally HPV-infected high-grade cervical intraepithelial neoplasia keratinocytes from human neoplastic cervical biopsies[J].Oncol Lett,2016,11(2):1457-1462.

[5]Pinto A E,Silva G L,Pereria T,etal.S-phase fraction and ploidy as predictive markers in primary disease and recurrence of papillary thyroid carcinoma[J].Clin Endocrinol(Oxf),2012,77(2):302-309.

[6]El-Deftar M F,EI Gerzawi S M,Abdel-Azim A A,etal.Prognostic significance of ploidy and S-phase fraction in primary intraoral squamous cell carcinoma and their corresponding metastatic lymph nodes[J].J Egypt Natl Canc Inst,2012,24(1):7-14.

[7]Pinto A E,Pires A,Sliva G,etal.Ploidy and S-phase fraction as predictive markers of response to radiotherapy in cervical cancer[J].Pathol Res Pract,2011,207(10):623-627.

[专业责任编辑：安瑞芳]

Culture and identification of human cervical epithelial cells in vitro

RUI Rui1, HONG Ying2

(1. Nanjing Medical University Affiliated Sir Run Run Hospital, Jiangsu Nanjing 211100, China;2. Nanjing University Affiliated Drum Tower Hospital, Jiangsu Nanjing 210000, China)

With increasing of the incidence of cervical cancer and precancerous diseases, the researches on their pathogenesis become more and more deeply. Since the successful culture of human cervical cancer cell in vitro, researchers have studied on culture of different types of cervical cells in vitro one after another. Specific keratin and immune markers of cervical epithelial cells are valuated to determine whether they are cervical cells. Observing the biological characteristics of different kinds of cultured cervical cells is the best way to explore the pathogenesis of cervical diseases and then to cure cervical diseases.

human cervical epithelial cells, cervical disease; in vitro culture; identification

2016-10-11

南京市医学科技发展资助项目(YKK14079)；江苏省科技厅科技支撑计划-社会发展资助项目(BE2012606)；国家卫生计生委科教司2015年公益性行业科研专项资助项目(201502004)。

芮 瑞(1980-)，女，主治医师，主要从事HPV感染人宫颈上皮细胞的研究。

洪 颖，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.10.040

R711.7

A

1673-5293(2016)10-1286-04