不同灵芝菌株功能性成分含量及其抗氧化活性比较

曹正+凡军民+谢春芹+吕兴萍+朱怡婷

摘要：采用不同方法提取并比较4种不同灵芝菌株功能性成分的含量及其抗氧化活性。结果表明：黑灵芝的多糖含量最高（P<0.05），达6.55 mg/g；大红芝的甘露醇含量最高（P<0.05），达21.92 mg/g；黑灵芝的总三萜含量最高（P<0.05），达170.53 mg/g；在1.0 mg/mL浓度下，赤芝、大红芝、黑灵芝、灵芝902多糖对DPPH自由基的清除率分别为81.88%、80.92%、80.30%、76.38%。由结果可见，不同灵芝菌株间的多糖、甘露醇和总三萜含量存在差异。抗氧化试验结果表明，4种灵芝菌株多糖清除DPPH自由基活性均较强，随着浓度的增大而升高。

关键词：灵芝；多糖；甘露醇；总三萜；抗氧化活性

中图分类号： S567.3+10.1 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）09-0281-02

灵芝（Ganoderma lucidum）是一种名贵的药用真菌，在亚洲作为药材使用已有2 000多年的历史。经现代药理学研究证明，灵芝具有抗肿瘤、免疫调节、镇静安神、强心及抗心肌缺血、调节血脂、平喘、保肝、降血糖、抗缺氧、清除自由基以及延缓衰老等药理作用[1-2]。这些药理活性与灵芝中多糖、三萜类、腺苷、生物碱、油脂类、甾醇类等功能性成分密切相关，其中多糖、三萜类化合物被认为是其主要药效成分，其含量成为衡量灵芝质量高低的重要指标[3-4]。目前，对不同灵芝菌株甘露醇含量的比较分析尚未见报道。

由于灵芝种类繁多，品种间的不同均可能会引起功能性成分在产量表达上的差异[3]。因此，本研究选取不同灵芝菌株，对其多糖、甘露醇及总三萜含量进行测定比较，并对多糖抗氧化活性进行研究，以期为灵芝的进一步研究和开发应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

大红芝、黑灵芝、灵芝902、赤芝，均采于江苏农博园食用菌基地。

1.2 试剂

95%乙醇、浓硫酸、苯酚、香草醛、高氯酸、冰乙酸、乙酸铵、乙酰丙酮、浓盐酸、高碘酸钠、L-鼠李糖、无水乙醇，均为国产分析纯；葡萄糖、甘露醇标准品，均购自阿拉丁试剂有限公司；齐墩果酸标准品，购自南京替斯艾么中药研究所；1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），购自美国Sigma公司。

1.3 仪器

756型紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精密实验设备有限公司）；FA2004N 电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；KQ 3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（金坛市富华仪器有限公司）；TDL-5A低速台式大容量离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；RE-5203旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；LGJ-12普通型冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 灵芝的预处理 将新鲜灵芝子实体去杂、切块、烘干、粉碎。

1.4.2 灵芝功能性成分的提取

1.4.2.1 多糖的提取与制备 脱脂：取灵芝子实体粉末，加入6倍体积的95%乙醇室温浸泡48 h，重复3次，滤渣风干待用。沸水提取：精确称取0.500 0 g脱脂的灵芝粉末，加100 mL 水，沸水浴提取2 h，冷却至室温，过滤，上清液定容至100 mL；移取20.0 mL提取液，缓缓加入80.0mL 95%乙醇，静置过夜，3 000 r/min离心15 min，沉淀物溶解定容至100 mL，溶液待测。多糖的制备：将沸水提取液减压浓缩，浓缩5～10倍，离心除沉淀；在浓缩液中缓缓加入95%乙醇（体积比1 ∶4），静置过夜、离心，沉淀物用蒸馏水溶解。透析：截留分子量为10 ku，截留液冷冻干燥。

1.4.2.2 甘露醇的提取 精确称取0.500 0 g灵芝粉末，加100 mL水，沸水浴提取2 h，冷却至室温，过滤，上清液加水定容至100 mL，溶液待测。

1.4.2.3 总三萜的提取 精确称取0.500 0 g灵芝粉末，加入10.0 mL无水乙醇，浸泡20 min，超声波提取30 min后，摇匀、过滤，滤液加水定容至50 mL，溶液待测。

1.4.3 灵芝功能性成分的测定

1.4.3.1 多糖含量测定 采用苯酚-硫酸法[5]。标准曲线的绘制：分别移取0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL的100 μg/mL葡萄糖标准溶液于6支试管中，加水至总体积为2.0 mL，再加入1.0 mL 5%苯酚溶液，混匀后迅速加入5 mL硫酸摇匀冷却，室温放置 20 min，于490 nm处测吸光度。以质量为横坐标、D490 nm为纵坐标绘制标准曲线。样品的测定：移取多糖提取液1.0 mL，按上述同样操作显色，根据标准曲线计算多糖含量。

1.4.3.2 甘露醇含量测定 采用高碘酸钠比色法[6]。标准曲线的绘制：分别移取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 25 μg/mL甘露醇标准溶液于具塞试管中，加蒸馏水至总体积为2.0 mL，加1.0 mL高碘酸钠试液，混匀，室温放置 10 min；加2.0 mL 0.1 %鼠李糖，再加4.0 mL新配制的Nash 试剂，53 ℃ 水浴 15 min，于420 nm测吸光度。以质量为横坐标、D420 nm为纵坐标绘制标准曲线。样品的测定：移取1.0 mL甘露醇提取液，按上述同样操作显色，根据标准曲线计算甘露醇含量。

1.4.3.3 总三萜含量测定 采用高氯酸-香草醛显色法[7]。标准曲线的绘制：分别移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 200 μg/mL齐墩果酸溶液于具塞试管中，70 ℃水浴挥干；加0.4 mL 5%香草醛-冰乙酸液，摇匀；再加入0.6 mL高氯酸，于60 ℃水浴20 min，冰浴冷却，加5.0 mL冰乙酸，摇匀，置室温15 min，于545 nm处测定吸光度。以质量为横坐标、D545 nm为纵坐标绘制标准曲线。样品的测定：移取1.0 mL总三萜提取液于具塞试管中，按上述同样操作显色，根据标准曲线计算三萜酸含量。

1.4.4 抗氧化活性测定 用DPPH法测定[8]，分别吸取4.0 mL 不同浓度样液与0.2 mmol/L DPPH溶液，加入具塞试管中摇匀，黑暗条件下于37 ℃放置30 min，3 000 r/min离心10 min，取上清液于517 nm处测吸光度，以维生素C作为阳性对照。清除率计算公式：清除率=[1-（Di-Dj）/D0]×100%。式中：Di为不同多糖含量下的吸光度；Dj为用无水乙醇代替DPPH溶液时测得的不同多糖含量本底吸光度；D0为用水代替多糖样品时测得空白对照吸光度。每个浓度平行做3次试验，计算清除率的平均值。

1.4.5 结果计算 采用软件SPSS 13.0，用Duncans法对试验结果进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同灵芝菌株的多糖含量比较

以葡萄糖标准溶液绘制标准曲线，建立线性回归方程：Y=6.502 4X+0.020 6，r2=0.997 4。式中：Y为D490 nm；X为葡萄糖溶液的浓度，mg/g。

由表1可见，不同灵芝菌株多糖含量间差异明显，黑灵芝中的多糖含量最高，达6.55 mg/g；其次是大红芝、灵芝902，多糖含量分别为6.04、5.76 mg/g（P<0.05）；赤芝含量最低，多糖含量为4.80 mg/g，与其他灵芝中的多糖含量差异极显著。

2.2 不同灵芝菌株的甘露醇含量

以甘露醇标准溶液绘制标准曲线，建立线性回归方程：Y=8.864X+0.060 1，r2=0.997 7。式中：Y为D420 nm；X为甘露醇溶液的浓度，mg/g。

由表2可见，不同灵芝菌株甘露醇含量差异明显，大红芝中所含的甘露醇含量最高，达21.92 mg/g，其次是赤芝，甘露醇含量达18.16 mg/g，黑灵芝、灵芝902的甘露醇含量较低，分别为8.80、5.05 mg/g。

2.3 不同灵芝菌株的总三萜含量的比较

以齐墩果酸标准溶液绘制标准曲线，并建立线性回归方程：Y=0.031X+0.069 8，r2 =0.996 3。式中：Y为D545 nm；X为齐墩果酸溶液的浓度，mg/g。

由表3可见，不同灵芝菌株总三萜含量差异明显，黑灵芝中的总三萜含量最高，达170.53 mg/g；其次是大红芝、赤芝，总三萜含量分别达149.62、131.27 mg/g；灵芝902的总三萜含量最低，为66.67 mg/g。

2.4 灵芝多糖抗氧化活性比较

由表4可知，4种不同灵芝菌株多糖清除DPPH自由基活性随着多糖含量的增大而升高。在1.0～4.5 mg/mL多糖含量范围内，同一浓度下赤芝、大红芝、黑灵芝的提取多糖清除DPPH自由基能力差异不显著，灵芝902多糖清除能力最差（P<0.05）；在1.0 mg/mL浓度下，赤芝、大红芝、黑灵芝、灵芝902多糖对DPPH自由基的清除率分别为81.88%、80.92%、80.30%、76.38%。

3 结论与讨论

本研究表明，黑灵芝的多糖含量最高，达6.55 mg/g；大红芝的甘露醇含量最高，达21.92 mg/g；黑灵芝的总三萜含量最高，达170.53 mg/g；在1.0 mg/mL浓度下，赤芝、大红芝、黑灵芝、灵芝902清除DPPH自由基活性分别为81.88%、80.92%、80.30%、76.38%。4种灵芝菌株间的功能性成分多糖、甘露醇和总三萜含量及其抗氧化活性存在显著差异。4种灵芝菌株的多糖清除DPPH自由基活性均随着浓度的增大而升高。灵芝多糖具有较强的抗氧化能力，其抗氧化能力可能与其他成分如酚类、黄酮、活性物质共同作用产生，需要进一步对其他活性物质进行测定分析。

参考文献：

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