泸宁鸡MyoD基因的克隆及生物信息学分析

龚静+林森+徐亚欧+贺庆华+林亚秋

摘要：为了研究MyoD基因在鸡生长发育与肉质形成中的作用，以泸宁鸡为研究对象，采用RT-PCR技术克隆MyoD基因序列，并利用生物信息学的方法，对其氨基酸同源性、理化性质等进行分析和预测。结果表明：泸宁鸡MyoD基因序列长度为988 bp，其编码的蛋白含299个氨基酸残基，具有碱性螺旋-环-螺旋结构（bHLH）；根据MyoD基因比对，构建的进化树显示泸宁鸡与人等哺乳动物的同源性为63%～67%，与原鸡、绿头鸭、游隼的同源性为94%～99%。

关键词：MyoD基因；基因克隆；泸宁鸡；生物信息学

中图分类号： S831.2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）09-0053-05

自Davis等首次对人类生肌决定因子（myogenic determining factor，MyoD）进行克隆以来，生物学家对该基因的结构特征及生物学功能产生了浓厚兴趣[1]；MyoD在肌肉生成早期分化过程中和成肌细胞增殖阶段进行表达，主要参与生肌过程[2]，具有决定肌卫星细胞能否成为肌肉干细胞的功能，并控制着整个肌肉的发育过程[3-5]，属于初级生肌调节因子（MRFs）。由于MyoD基因产物在多种分化细胞向肌细胞转化的过程中扮演了重要角色，因此，近年来在动物肉质改良育种工作中，对该基因的研究成为热点。对于成年动物而言，MyoD基因可以调节控制肌细胞的增殖、分化和肌肉组织的增生[6]。Akizawa等学者研究表明，MyoD可与肌球蛋白、肌细胞生成素及肌酸激酶CK等基因的启动子区结合，正调控骨骼肌的生长发育[7-8]。Liu在研究火鸡胚胎发育时发现，随着火鸡的胚胎发育，MyoD的mRNA表达量呈显著下降趋势[9]。Gayraud-Morel等学者指出了，MyoD和Myf5表达量在成年动物的骨骼肌发育有关[6]。国外学者Powell等、国内学者李娟等研究发现，营养状况对动物肌卫星细胞的分裂活性以及肌肉发育有重要影响，并且赖氨酸、蛋氨酸、胱氨酸及亮氨酸的浓度与MyoD蛋白表达水平有着正相关关系[10-16]，以上均表明MyoD在动物肌肉生长中具有不可或缺的调控作用。

基于上述研究，对MyoD的功能研究显得尤为重要，但目前研究多集中于猪、牛、山羊等动物[17-21]，而关于禽类MyoD基因特征研究报道相对较少，并尚未见在泸宁鸡的研究中报道。泸宁鸡作为四川凉山州肉蛋兼用型的优质地方养殖鸡种，胸腿肌占胴体质量比例较大，耐粗饲，抗病力强，是一个有发展前途的地方良种鸡[22]。因此，本研究以泸宁鸡为研究对象，通过克隆MyoD基因，并分析其基因及编码蛋白特征，探讨MyoD基因在泸宁鸡生长、发育过程中的作用具有实际的理论和应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验动物及试剂

试验用的泸宁鸡采自四川省凉山州冕宁县原生农业有限公司，屠宰后迅速采其肌肉组织样品置于液氮中以备用；主要试剂为：Taq酶及DH5α感受态细胞[天根生化科技（北京）有限公司产品]，转化载体pMD19-T及反转录试剂盒（大连TaKaRa），Trizol试剂（Invitrogen公司），胶回收试剂盒（博大泰克生物技术有限公司）。

1.2 MyoD基因引物的设计与合成

依据原鸡的MyoD基因序列（GenBank中登录号为NP_989545.2）设计扩增ORF的上、下游引物（设计软件为Premier 5.0）[PF（上游），5′-ACCGCCATCTCACCCCACTC-3′；PR（下游），5′-TGGCTGAACGGAGCAATTTGTT-3′]，送往生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 泸宁鸡MyoD基因克隆

泸宁鸡肌肉组织样中的总RNA提取办法参考梅寒等在泸宁鸡MyoG基因克隆中的办法[23]。经分光光度仪检测，将质量符合要求的泸宁鸡总RNA进行反转录，得到的产物进行PCR扩增，25 μL反应体系包括：PF和PR各1 μL，cDNA1 μL，9.5 μL灭菌去离子水，最后加Taq酶12.5 μL。其反应条件分别为：在94 ℃温度下预变性5 min；94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s 35个循环；72 ℃延伸5 min。胶回收，凝胶电泳检测得到目的条带产物，连接于pMD-19T载体（温度为16 ℃，时间为45 min），转入感受态细胞（DH5α），提取经筛选得到阳性克隆质粒，送Invitrogen公司测序。

1.4 泸宁鸡MyoD基因氨基酸残基序列分析

克隆测序所得的MyoD序列经软件拼接并翻译成相应氨基酸序列（DNAman软件），并利用该软件对比分析泸宁鸡与其他物种之间的同源关系，制作进化树。利用上述翻译得到的蛋白质氨基酸残基序列，通过在线软件（www.expasy.org）分析MyoD蛋白质的分子量、等电点等理化性质，通过在线软件（www.cbs.dut.dk/servcs/）对其信号肽序列、蛋白磷酸化位点、N-糖基化位点及O-糖基化位点进行分析。

2 结果与分析

2.1 总RNA提取结果

利用上述方法提取到泸宁鸡肌肉组织样中的总RNA。由图1可知，虽然5S较浅，但容易分辨出28S、18S，条带非常清楚，说明泸宁鸡的总RNA提取是比较完整的。再用分光光度仪检测发现D260 nm/D280 nm的值介于1.8～2.0，表明提取的泸宁鸡总RNA纯度符合进一步试验的要求。

2.2 泸宁鸡MyoD基因cDNA的克隆

由图2可知，泸宁鸡MyoD基因采用RT-PCR技术扩增获得长度为988 bp的特异性条带，得到的核苷酸及推测出对应的氨基酸残基序列。位于40 bp位点的ATG作为MyoD cDNA的起始密码子，其终止密码子居于937 bp处，整个序列包括完整的开放阅读框（ORF）共编码299个氨基酸，其中核苷酸序列的碱基组成分别为A=23.4%、T=15.4%、C=33.8%、G=27.3%。

2.3 泸宁鸡MyoD蛋白保守结构域预测

由图3可知，经DNAman软件处理克隆得到988 bp长度的泸宁鸡MyoD基因序列，得到1个由299个氨基酸残基组成的一级结构编码序列，该序列清楚地反映MyoD蛋白具有保守的碱性螺旋-环-螺旋结构区域（basic helix-loop-helix，bHLH）。

根据SMART软件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）预测结果发现，泸宁鸡MyoD蛋白包括2个低组分复杂性区域（从196～208个氨基酸，从220～231个氨基酸） 和1个b-HLH 结构域（螺旋-环-螺旋结构域，从107～158个氨基酸）。

2.4 蛋白二级结构及三级结构预测

通过在线软件NPSA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）分析结果推测泸宁鸡MyoD蛋白具有的二级结构（图4），结果显示，泸宁鸡MyoD编码的蛋白中含299个氨基酸残基，其中58 个（19.40%）氨基酸残基可能形成α-螺旋（h），34个（11.37%）氨基酸残基可能形成延伸链，207个（69.23%）氨基酸残基可能形成无规则卷曲结构（c）。用在线软件Swiss model预测MyoD蛋白的三级结构，结果显示该蛋白为螺旋-环-螺旋二聚体，这与上面蛋白质保守结构预测结果是一致的。

2.5 蛋白理化性质分析

在线（http：//web.expasy.org/protparam/）分析结果表明，泸宁鸡MyoD蛋白分子式为C1409H2198N422O468S19，包括299个氨基酸残基，其中带负电荷的谷氨酰胺（Glu）残基和天冬酰胺（Asp）残基总共为41个，带正电荷的精氨酸（Arg）残基和赖氨酸（Lys）残基总共为30个。由此可以看出，MyoD蛋白中负电荷氨基酸残基总数多于正电荷，可推定该蛋白可能带负电荷。其分子质量33.15 ku，结合不稳定系数为69.54，理论等电点为5.74，平均疏水指数为-0.787。

2.6 蛋白磷酸化与糖基化位点预测结果分析

通过在线预测软件（http：//www.cbs.dtu.dk/）对MyoD蛋白氨基酸序列进行磷酸化位点及糖基化位点进行预测，结果[KG*8]发现具有32个磷酸化位点及17个糖基化位点，其中含有22个丝氨酸（Ser） 磷酸化位点、5有个苏氨酸（Thr） 磷酸化位点、5个酪氨酸（Tyr） 磷酸化位点、3个N-糖基化位点及14个O-糖基化位点。

2.7 蛋白质疏水性分析

采用 ExPASy 软件工具的 ProtScale 程序（http：//web.expasy.org/protscale/）推测泸宁鸡MyoD基因所编码蛋白的亲水、疏水性。结果显示，最强疏水性位于第89位氨基酸处，其值为1.544；最强亲水性位于第56位氨基酸处，其值为-2.989。按分值大小（Score>1.5）划分发现，具有极少的疏水性序列，但亲水性高的区域具有多个，大部分氨基酸属于亲水性氨基酸，这与理化性质中的预测结果相一致。

2.8 蛋白信号肽及跨膜结构分析

通过软件TargetP和TMHMM在线进行在线推测发现，泸宁鸡MyoD蛋白不具备信号肽及跨膜螺旋结构存在的条件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/）。

2.9 蛋白亚细胞定位及蛋白相互作用分析

通过PSORT Ⅱ 预测，该蛋白主要在核（87.0%）、细胞质（8.7%）和细胞骨架（17.4%）上发挥生物学作用。

由图5可知，利用STRING交互式数据库进行搜索MyoD蛋白相互作用，条件限制在10个蛋白以内。搜索结果表明，MyoD蛋白（即图5中的MyoD1蛋白）可能和SMAD3、TCF3、MEF2A、MYH1、PAX7、MYB、KAT2A、KAT2B、MEF2C、MEF2D等10个蛋白存在相互作用。

2.10 泸宁鸡MyoD基因及其编码氨基酸序列与其他物种同源性的对比分析

通过GenBank中登录的禽类及其他物种的氨基酸序列与泸宁鸡MyoD蛋白氨基酸序列进行同源性对比分析（表1）及构建物种间进化树进行聚类分析（图6）可知，泸宁鸡与其他禽类的MyoD基因有较高的同源性，与人、猪等哺乳动物的同源性较低。

3 结论与讨论

自人类发现并克隆MyoD基因[1]以来，生物学家对MyoD基因的研究从未停止。Charge等在研究中发现，MyoD基因在肌肉发育初对成肌前体细胞能否转化成肌肉细胞具有主宰作用，并且能够促进转化成的肌肉细胞增殖[24]。Tapscott 等通过将小鼠的MyoD基因转入成纤维细胞试验，发现该细胞在MyoD基因诱导下出现了成肌作用，证实MyoD与肌肉发育两者之间确实存在关联[25]。MyoD基因相对于其他生肌调节因子 （myogenic regulatory factors，MRFs）而言， 在肌肉细胞系的分化过程中、骨骼肌成肌形成时、脊椎动物胚胎期肌肉发育期均起到关键作用，该基因缺失可直接致使成肌细胞的增殖和分化无法顺利完成[26-28]。因此，对泸宁鸡MyoD基因进行研究可在泸宁鸡的育种工作中，为改善泸宁鸡生长速度和肉质品质等后续研究奠定基础。

本研究克隆得到长度为988 bp的泸宁鸡MyoD基因片段，其核苷酸序列碱基组成中GC含量约为61.1%，数值较高，容易推测该基因DNA密度较高，并具有热与碱均不易使之变性的较高稳定性。该基因共编码的299个氨基酸中含有2个低组分复杂性区域和1个b-HLH结构域，这与生肌调节因子（MRFs）家族的结构特征具有一致性[29]。在肌肉发生过程中，MyoD基因与其他3个生肌调节因子一起各自发挥着不同的调节、控制作用[30]。

在线预测发现，磷酸化位点共有32个，糖基化位点17个。由此推定，MyoD蛋白在骨骼肌生长发育中所起的开关作用在一定程度上与这些位点有着紧密的关系。通过TargetP 和TMHMM推测可知，泸宁鸡MyoD蛋白不具有信号肽及跨膜螺旋结构，由此可推定该基因蛋白质类型应为非分泌型。

泸宁鸡MyoD基因编码的氨基酸序列与人等哺乳动物、鸡等禽类动物及斑马鱼等鱼类的同源性为63%～99%，说明MyoD基因在不同的物种中作用方式可能存在一定差异[31]，保守性不算太高。进化树分析结果表明，该研究中泸宁鸡与鸡、游隼、绿头鸭的亲源关系较近，与人、猪等哺乳动物的亲缘关系相对较远，这与传统的形态学分类和生化特征分类的进化地位是相吻合的，表明MyoD在用于物种与物种间的系统进化关系分析中具有一定的价值。

本试验对该基因编码的蛋白分子性质主要是通过生物信息学进行预测的，仍须通过试验对该基因进行进一步研究。

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