温度对犬精液冷冻保存的研究

刘晋津佘静伟吴 腾郝志明

（1.天津市南开医院实验动物室，天津 300100；2.天津市西青区畜牧水产业发展服务中心，天津 300380；3.天津农学院，天津 300384）

温度对犬精液冷冻保存的研究

刘晋津1佘静伟2吴 腾1郝志明3*

（1.天津市南开医院实验动物室，天津 300100；2.天津市西青区畜牧水产业发展服务中心，天津 300380；3.天津农学院，天津 300384）

本实验在以往研究的基础上进一步研究了冷冻起始温度（始冻温度）、解冻温度对精子活率的影响.实验结果表明:始冻温度为-70℃时冻后精液质量最好，冻后镜子活率达0.6284±0.0408，优于-65℃和-75℃时的冻后精子活率；解冻温度为70℃时对解冻后精液质量最好，达0.6810±0.0324，明显优于60℃和65℃的精子活率。

冷冻；精子；始冻温度；解冻温度

由于畜牧业的发展需要，牛的冻精在市场上比较常见。随着生物技术、动物学、繁殖学的不断发展，尤其是体外受精技术的不断完善使犬精液的冷冻保存越来越受到关注。犬作为人类最亲密的朋友，为人类的科研发展以及宠物饲养做出了巨大的贡献，犬精液的冷冻保存在选种、基因改良、遗传病研究，提高公犬利用率等诸多方面都有独特的优势。

1780年，意大利生理学家SpMlanzani第一次进行了犬的人工授精实验。此后，Seager，Olar TT、Yu I、Cardoso RDS等人在这方面做了诸多工作。美国早在二十世纪七十年代就投入了大量精力研究犬精液的冷冻保存。

相较于国外，国内研究起步相对较晚，目前并没有形成一套成熟的方法。张志光、郝志明、潘寿文等人对影响犬精液冷冻保存的诸多因素做了研究，取得了一定的进展。

本实验在以往的经验基础上，以Tris-葡糖糖为稀释液，液氮面上2cm处熏蒸，对始冻温度和解冻温度进行更为细化的研究，以便找到更为合适的犬精液保存方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物

雄性大丹犬，3岁，身体健康，精液品质良好。

1.2 实验器械和试剂

1.2.1 实验器械

离心机：型号DT5-1，北京时代北利离心机有限公司；

显微镜：型号36XL，上光精密光学检测仪器销售有限公司；电子天平：型号T500，常熟市双杰测试仪器厂；集精杯：玻璃漏斗插入量筒，以棉塞封口制成；

1.2.2 稀释液

用双蒸水配置基础稀释液（Tris3%，柠檬酸1.9%，葡萄糖1.5%）。用等体积的75%的基础稀释液加入25%的卵黄配置成稀释一液，再将等体积的85%稀释一液加入15%的甘油，配置成稀释二液。

1.3 实验方法

1.3.1 人工按摩采精

绑定实验犬，手握法采集精液。我们将射精分为三段，第一段为刚刚射精阶段，第二部分为射精中段，第三部分为射精尾段（射精即将结束），采精时注意收集精液的中间部分，观察精液色泽、气味，显微镜下估算精子活率。

1.3.2 鲜精处理及保存

调试离心机，使刚刚采集的鲜精在2000rpm下离心5分钟。弃掉上清液，向管中加入等温的稀释一液并混匀，封口。放入盛有500ml，30℃热水的烧杯中，将烧杯放入4℃冰箱保存。18个小时后，将已预冷至4℃等体积的稀释二液缓慢加入精液中，混匀后再次放回4℃冰箱保存4h。

1.3.3 冷冻前准备

（1）测量液氮面高度：将液氮罐提桶试探性插入罐内，当听到斯拉声时，停止插入，用刻度尺量出插入的深度，此深度即为液氮面高度。

（2）精液装管：将精液吸入细管，使精液距细管口大约为1.0cm，封口。

1.3.4 冷冻

将装有精液的细管插入已预冷至-65℃、-70℃、-75℃的细管插座内，立即放入液氮罐内液面上方2cm处进行熏蒸，10min后，取出细管，立即投入液氮内。

1.3.5 解冻和冻后精子活率的检查

从液氮罐中取出细管，放入65℃的水中解冻5s。在400倍镜下测定精子活率。

1.4 统计方法

实验数据按单因子试验进行统计分析，并进行显著性检验。

2 实验结果

2.1 始冻温度对冻后精子活率的影响从表 1 可以看出，冻后精子活率随始冻温度的不同而变化。始冻温度为-70℃时冻后精子的活率显著高于始冻温度为-65℃和-75℃时的活率（P〈0.05），为0.6284±0.0408。但始冻温度为-65℃时和-75℃时的活率间则没有明显的差异（P＞0.05）。

表1 始冻温度对冻后精子活率的影响

2.2 解冻温度对冻后精子活率的影响

表2 解冻温度对冻后精子活率的影响

从表1的研究结果看-70℃的始冻温度效果最好。我们将-70℃设为始冻温度来研究解冻温度。从表2可以看出，精子的活率随解冻温度的升高而提高。解冻温度为65℃和70℃时冻后精子活率为0.6110±0.0742和0.6810±0.0324，极显著高于解冻温度为60℃时的活率（P〈0.01）。解冻温度为70℃时的冻后精子活率显著高于解冻温度为65℃时的活率（P〈0.05），为0.6810±0.0324。

3 讨论

3.1 精液采集

采精环节是本实验的基础。采精方法有很多种，例如假阴道法、按摩采精法、电刺激法等等。相较于其他方法，人工按摩采精法简单可靠，只要实验人员细心，就可以很好的将射精的三个阶段分开，收集精液最为良好的部分。

3.2 始冻温度的探讨

当精液的温度由0℃缓慢降到-60℃时，精液中的水分由液态变为固态，对精细胞的细胞器造成巨大的破坏。因此，研究人员的实验经验表明0℃--60℃是精子的破坏区域。但是，在保护剂的参与下，精液温度快速降到-60℃以下，固态精液呈现玻璃态，不会对细胞器造成破坏。潘寿文等人在二十世纪八十年代就对犬精液低温保存进行过研究，结果表明-80℃时效果最为理想（0.4500±0.0447），郝志明等人研究发现-113℃则精子死亡率上升（0.1250±0.0612）。本实验在以往的基础上进一步研究，发现始冻温度为-70℃时效果更为理想，为0.6284±0.0408。而-75℃时则精子活率降低。综合来看，温度的变化（-65℃、-70℃、-75℃、-80℃、-113℃）并没有一条理想的曲线表明精子的活率是随着温度曲线的变化而有规律的升高或者降低。其中的规律还需要进一步研究。

3.3 解冻温度的探讨

研究表明，精子在低温状态下代谢几乎停止，使其能够保存。一旦升温，精子又能复苏。Olar TT等人对解冻温度做过系统的研究，结果表明高温快速解冻效果更好。熊前等人研究发现采用高温水浴快速解冻方法，犬精子的活力最佳。郝志明等人研究发现65℃解冻5s效果理想，本实验研究发现70℃解冻5s要比65℃更好，为0.6810±0.0324。可见高温快速解冻更适于精子的成活。那么快速的使精子通过不适宜生存的低温区是实验成功的关键。市场上牛的体外受精比较常见，原因在于牛冻精的成活率高，市场比较成熟。本实验表明始冻温度为-70℃，解冻温度70℃时，精子成活率在0.6810±0.0324，在配套设施完善的条件下完全有理由应用于实际生产。

［1］ Seager SJW. Successful pregnancies utilizing frozen dog Semen［J］. A. I. Digest，1969，（17）：6-16.

［2］ Olar TT，Bowen RA and Pickett BW.Influence of extender，cryopreservative and seminal processing procedures on postthaw motility of canine spermatozoa frozen in straws［J］.Theriogenology，1989，31（2）：451-461.

［3］ Cardoso RDS et al Cryopreservation of canine semen using a coconut water extender with eggyolk and three different glycerolconcentrations［J］.Therio-genology，2003，59（3-4）：743-751.

［4］ 张志光，刘清神，刘运忠.不同稀释液对Beagle犬精液保存效果的比较［J］.广东畜牧兽医科技，2013，（6）：37-40.

［5］ 郝志明，王伟峰，潘敏.犬精液低温保存稀释液的研究［J］.甘肃畜牧兽医，2005，（6）：16-19.

［6］ 潘寿文，刘湖，马大君.犬的精液冷冻技术［J］.畜牧与兽医，1986，（3）：105-106.

［7］ 熊前，叶俊华，吴衍，等.犬精液冷冻与解冻方法的研究报告［J］.当代畜牧，2008，（4）：39-40.

［8］ 郝志明，姚金宇，王章龙，等.犬精液冷冻解冻技术研究［J］.甘肃畜牧兽医，2005，35（5）：9-12.

刘晋津（1984—），男，助理兽医师，主要从事实验动物中心的管理、动物实验、畜牧兽医后勤保障，遗传育种研究等。

郝志明（1963—），男，教授，工作于天津农学院，研究方向为动物生殖生理和生殖技术。