某池塘鱼细菌感染的暴发调查

陈明非

（大连市畜牧总站，辽宁大连　116037）

某池塘鱼细菌感染的暴发调查

陈明非

（大连市畜牧总站，辽宁大连116037）

辽宁省大连市某人工池塘养殖的淡水鱼苗出现大量死亡。从病死鱼体内分离到一株致病性嗜水气单胞菌和一株类志贺邻单胞菌。对鱼饲料、池塘环境样品进行细菌计数与优势菌筛查，发现池底淤积物和池塘排水管污物中细菌总数严重超出限值，优势菌为致病性嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌和摩氏摩根菌，与病死鱼体内分离到的细菌基本一致。由此判断引起池塘鱼感染的细菌主要来源于池底淤积物和池塘排水管污物。

淡水鱼苗；细菌感染；暴发调查；池塘；优势菌；嗜水气单胞菌；类志贺邻单胞菌

池塘养鱼是辽宁省的主要淡水鱼养殖方式［1］。部分养殖户为降低成本，不注重清塘、换水工作，盲目增加养殖密度，导致细菌病频发。目前，对鱼细菌性疾病防治主要采取水质消毒及投喂抗生素等措施，这无法从根本上解决问题。而且长期、大量使用抗生素，不仅会导致细菌耐药性的产生，也会引起公众对食品安全的担忧。

2015年9月辽宁省大连市一处池塘暴发了鱼细菌性疾病。大连市畜牧总站随即对该起疫情进行了病原的分离鉴定和感染源的查找，通过溯源性暴发调查为池塘鱼细菌性疾病的综合防控提供依据。

该池塘占地约8亩，属于人工挖制的封闭性池塘。池塘四壁用水泥砌成，池底铺防渗膜。池塘水引自地下井水，池塘水深2 m左右，进水口位于池塘高处，排水管有一低一高两个。2015年9月初放养体重约150 g的鱼苗8 000尾，以鲫鱼为主。放养10 d后，鱼苗陆续出现死亡，每天死亡70～100尾，至9月底，鲫鱼苗死亡率达到40%。死亡鱼体表充血，肛门红肿，眼球突出。剖开腹腔发现有红色积水；肝、脾呈暗红色，易碎；肠内无食物并有一定程度的糜烂。

1　材料

1.1 样品

1.1.1 病死鱼。体表、眼眶、鳃盖等处有明显充血症状的濒死鱼。

1.1.2 溯源样品。采集地下井水、池塘水、池底淤积物、排水管污物、鱼饲料。

1.2 试剂与仪器

营养琼脂、血液琼脂基础、1%脱脂奶蔗糖胰蛋白胨，购自北京陆桥技术股份有限公司；脱纤绵羊血，购自大连医科大学实验动物中心；VITEK2细菌生化鉴定卡，购自法国生物梅里埃公司。细菌鉴定设备为法国生物梅里埃公司VITEK2全自动细菌鉴定系统。

2　方法

2.1 病死鱼检验

2.1.1 细菌分离及纯化。用酒精消毒病死鱼体表，剪开腹部，无菌采集肝、脾、腹水。采用划线法将病料接种于营养琼脂培养基，28 ℃培养24 h；挑取多个独立菌落进行纯化培养；两次纯化后，对获得的菌株进行标记，并用斜面培养基保存。

2.1.2 细菌理化特征鉴定。将保存的纯化菌株分别接种于绵羊血琼脂平板和1%脱脂奶蔗糖胰蛋白胨平板，28 ℃培养24 h，观察溶血现象和溶蛋白现象；对菌株进行革兰氏染色镜检。根据镜检结果选择VITEK2细菌生化鉴定卡，进行细菌鉴定。

2.2 溯源样品检验

2.2.1 样品稀释与培养。用灭菌水将每种溯源样品分别做101～108稀释，参照饲料中细菌总数的测定方法［2］，将所有稀释度样品接种营养琼脂，28 ℃培养48 h。

2.2.2 细菌计数。选择平均菌落数在30～300之间的培养皿进行计数。计数后，再乘以稀释倍数，得出每毫升溯源样品的细菌总数。

2.2.3 优势菌纯化。观察培养基上细菌的菌落形态，配合革兰氏染色镜检，确定优势菌；对优势菌进行分离纯化。

2.2.4 优势菌生化鉴定。根据革兰氏染色镜检结果，选择VITEK2细菌生化鉴定卡对纯化的优势菌进行鉴定。

3　结果

3.1 细菌学试验结果

3.1.1 细菌培养特征。从病死鱼中分离到2株细菌。这2株细菌在营养琼脂上的生长特征十分相似：28℃培养24 h形成圆形、白色半透明、表面光滑、边缘整齐、直径1.5 mm左右的菌落。但其中1株菌在绵羊血琼脂平板上能形成明显的β-溶血环，在1%脱脂奶蔗糖胰蛋白胨平板上形成透明的溶蛋白圈，将其命名为HQY-A；另1株菌则无溶血、无溶蛋白现象，将其命名为HQY-B。

3.1.2 分离菌理化特征。 革兰氏染色镜检发现，HQY-A、HQY-B均为G-、无芽胞的短小杆菌。选择VITEK2革兰氏阴性菌生化鉴定卡，按说明书操作，经VITEK2全自动细菌鉴定系统鉴定，HQY-A为嗜水气单胞菌，HQY-B为类志贺邻单胞菌。2株菌的生化试验详情见表1和表2。鉴于HQY-A蛋白酶试验阳性，判定其为致病性嗜水气单胞菌［3］。

表1　HQY-A（嗜水气单胞菌）生化试验结果

表2　HQY-B（类志贺邻单胞菌）生化试验结果

3.2 溯源样品细菌学试验结果

3.2.1 溯源样品细菌总数。地下井水、鱼饲料中细菌总数很低，池塘水中细菌总数也在限值内，而池底淤积物、出水管污物中的细菌总数大大超出限值［4-5］。样品中的细菌总数见表3。

3.2.2 溯源样品中的优势菌。池塘水、池底淤积物、出水管污物培养的优势菌经纯化鉴定为嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌和摩氏摩根菌。其中的嗜水气单胞菌在1%脱脂奶蔗糖胰蛋白胨平板上也能形成透明的溶蛋白圈，判定其为致病性嗜水气单胞菌。

表3　溯源样品的细菌计数（CFU/mL）

4　讨论

本次试验从病死鱼中分离到嗜水气单胞菌和类志贺邻单胞菌。这2株菌在普通营养琼脂上的形态特征十分相似，因此在进行此类病原菌检验时要格外小心，以免漏检。嗜水气单胞菌在绵羊血琼脂平板表现明显的β-溶血，在脱脂奶蔗糖胰蛋白胨平板上形成透明的溶蛋白圈，充分说明这是一株致病性嗜水气单胞菌。

嗜水气单胞菌是一种人畜鱼共患病原菌。尤其作为淡水鱼类的重要致病菌，因养殖环境、鱼的大小、种类等原因，可引起多种症状［6］。临床上有大量嗜水气单胞菌引起鱼类败血症、腹水病等的报道［7-8］。嗜水气单胞菌的致病性与相关毒力因子的关系密切。这些毒力因子有外毒素、蛋白酶、S层、菌毛、转铁蛋白和外膜蛋白等［8］。其中蛋白酶常用来鉴别致病性与非致病性嗜水气单胞菌，凡蛋白酶阳性的嗜水气单胞菌均具有致病性［3］。嗜水气单胞菌的外毒素是重要的致病因子，具有溶血性、肠毒素毒性和细胞毒性［9］。

类志贺邻单胞菌是广泛分布在淡水环境中的细菌，是引起人类胃肠炎的重要病原之一［6］。国内关于类志贺邻单胞菌是否引起水生动物发病的报道不一。从草鱼、鲟、温泉鱼等分离到的致病性类志贺邻单胞菌，有单一致病的，也有和其他致病菌协同致病的［10-12］。朱越雄等［13］从中华绒鳌蟹中分离到非致病性类志贺邻单胞菌，同时还分离到致病性嗜水气单胞菌；左跃等［14］从暴发“裂头病”的黄颡鱼中分离到2株非致病性类志贺邻单胞菌。目前没有国家标准来确定类志贺邻单胞菌的致病性。本次试验没有进行人工感染试验，因此不能确定分离到的类志贺邻单胞菌是否对鱼具有致病性。但类志贺邻单胞菌是引起人类胃肠炎的重要病原之一，也能引起水禽、犬、貂等动物发病［6］。因此，对病死鱼及池塘污染水不能随意丢弃和排放，要进行无害化处理，切断鱼与人、畜的传播途径。

本次调查侧重寻找感染源，结果发现水源和鱼饲料中的细菌量很少，不是致病菌来源。养殖户因定期用漂白粉对池塘水消毒，所以池塘水的细菌总数在限值以下，致病菌浓度也在有效发病浓度以下。但池底淤泥以及排水管污物中因含有大量鱼粪便、腐败的饲料和鱼体，消毒剂根本无法发挥作用，致病菌的浓度远远超过发病浓度。从池塘环境样品中分离到的3株优势菌中，有2株与发病鱼体内分离到的菌株相同，分别是致病性嗜水气单胞菌和类志贺邻单胞菌，由此判断引起鱼发病的致病菌主要来源于池底淤泥和排水管污物。另外池塘环境样品中还有1株优势菌为摩氏摩根菌。这是一种腐生菌，广泛分布于各种水源、土壤中，特别是动物蛋白腐烂的地方［6］。摩氏摩根菌是一种条件性致病菌，国内有从患病的水生动物中分离到该菌的报道，如中华鳖、锦锂等［15-16］。

根据本次池塘鱼细菌感染的暴发调查结果，建议养殖户及时捞出死鱼，及时清除池底表层及排水管中污物，更换部分池塘水，对池塘全面消毒；建议投喂敏感抗菌药，同时配合投喂解毒、增强抵抗力的药物；在冬季空塘时，排干池塘水，挖出池底淤泥，使池底在自然条件下晾晒一段时间，再次养鱼前要用药物彻底消毒池塘的每一个角落。这样才能保证彻底消灭病源。

［1］赵永锋，胡海彥，蒋高中，等. 我国大宗淡水鱼的发展现状及趋势研究［J］. 中国渔业经济，2012，30（5）：91-99.

［2］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会. 饲料中细菌总数的测定：GB/T13093—2006［S］. 北京：中国标准出版社，2006.

［3］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会. 致病性嗜水气单胞菌检验方法：GB/ T18652—2002［S］. 北京：中国标准出版社，2002.

［4］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会. 饲料卫生标准：GB 13078—2001［S］.北京：中国标准出版社，2001.

［5］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会. 渔业水质标准：GB 11607—89［S］. 北京：中国标准出版社，2005.

［6］东秀珠，蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册［M］. 北京：科学出版社，2001.

［7］田甜. 鱼源嗜水气单胞菌的分离鉴定及耐药性研究［D］.武汉：华中农业大学，2010.

［8］王友娟，李荣峰，李华，等. 辽宁地区养殖淡水鱼感染嗜水气单胞菌的流行病学调查［J］. 中国农业科技导报，2012，14（4）：128-134.

［9］杨守明，王民生. 嗜水气单胞菌及其对人的致病性［J］. 疾病控制杂志，2006，10（5）：511-514.

［10］胡钱东，林强，石存斌，等. 草鱼致病性类志贺邻单胞菌的分离与鉴定［J］. 微生物学报，2014，54（2）：229-235.

［11］余华，何智，严玉宝，等. 温泉鱼致病性类志贺邻单胞菌和舒氏气单胞菌的分离鉴定和药敏试验［J］. 中国动物检疫，2009，26（7）：37-39.

［12］王小亮，徐立蒲，曹欢，等. 鲟致病性类志贺邻单胞菌的鉴定和药物敏感性［J］. 微生物学报，2013，53（7）：723-729.

［13］朱越雄，贡成良，薛仁宇，等. 中华绒鳌蟹组织中一株类志贺邻单胞菌的分离与特性分析［J］. 中国微生态学杂志，2001，13（5）：263-264.

［14］左跃，易弋，夏杰，等. 2株黄颡鱼源类志贺邻单胞菌的分离与鉴定［J］. 江苏农业科学，2013，41（9）：199-201.

［15］马有智，舒妙安. 一种中华鳖穿孔病病原菌的分离和特性研究［J］. 浙江大学学报（农业与生命科学版），2000，26（4）：414-416.

［16］陆小萏，邹为民，谭爱萍，等. 锦鲤摩氏摩根菌的鉴定及致病性研究［J］. 淡水渔业，2005，35（2）：3-5.

（责任编辑：朱迪国）

An Outbreak Investigation on Fish Bacterial Infections in a Pond

Chen Mingfei
（Dalian Animal Husbandry Station，Dalian，Liaoning 116037）

The mass mortality of freshwater fish fries in one artificial pond was found in Dalian city of Liaoning province. In order to find out its causes，the pathogens were isolated and identified. As a result，one strain of pathogenic Aeromonas hydrophila and one strain of Plesiomonas shigelloides were isolated from the fish died from the disease. Then the samples of fi sh feed and pond environment were examined by bacteria counting and predominant bacteria screening. It was found that the total bacteria in pond bottom mud and drain pipe sewage exceeded the limit seriously and the predominant bacteria were pathogenic Aeromonas hydrophila，Plesiomonas shigelloides and Morganella morganii，which were basically identical with the isolates from the mentioned dead fish. Thereby，the reason of bacterial infection of fi sh in this pond could be derived from bacteria existing in pond bottom mud and drain pipe sewage.

freshwater fish fry；bacterial infection；outbreak investigation；pond；predominant bacteria；Aeromonas hydrophila；Plesiomonas shigelloides

动物检疫

S942.2

B

1005-944X（2016）11-0015-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.11.005