miR-150基因缺失对小鼠繁殖和血液学指标的影响①

郑全辉　田　枫　李文婷　张秋如　王　姗

(华北理工大学基础医学院，河北省慢性疾病重点实验室，唐山市慢性病临床基础研究重点实验室，唐山063000 )



·基础免疫学·

miR-150基因缺失对小鼠繁殖和血液学指标的影响①

郑全辉田枫②李文婷张秋如王姗

(华北理工大学基础医学院，河北省慢性疾病重点实验室，唐山市慢性病临床基础研究重点实验室，唐山063000 )

目的：探讨miR-150基因缺失对小鼠繁殖和血液学指标的影响。方法：采用miR-150ko小鼠，观察该小鼠的窝产仔数和离乳率及生长曲线，测定其生殖指标；以全自动血球计数仪和自动生化分析仪测定2月龄miR-150ko小鼠和正常对照C57BL/6J小鼠血液细胞学和血清生化参数。结果：miR-150ko小鼠窝产仔数与离乳率与C57BL/6J正常对照小鼠相比均显著下降；miR-150ko小鼠外周血白细胞计数、中间细胞数、中性粒细胞数、中间细胞百分比、中性粒细胞百分比与C57BL/6J小鼠相比显著升高；而血小板计数、淋巴细胞百分比显著下降；miR-150ko小鼠的血清葡萄糖、总胆固醇水平较正常对照小鼠显著增高。结论：miR-150基因缺失可影响到小鼠的繁殖功能，并对某些血液细胞学指标及血糖、胆固醇水平产生影响。

miR-150；基因缺失；小鼠；繁殖；血液学

miR-150是一个在哺乳动物组织广泛表达的microRNA。已有研究表明，miR-150在乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌等实体瘤细胞和T、B淋巴瘤等白血病细胞中发挥癌基因或抑癌基因的作用[1,2]。另外，miR-150在系统性红斑狼疮、重症肌无力、多发性硬化症、败血症等自身免疫性和感染性疾病中发生表达变化[3-5]，通过调控miR-150的表达，可以影响以上疾病的发生或进展。可见，miR-150在多种组织、细胞的发育、分化、凋亡及转化等生理或病理过程中发挥作用。然而到目前为止，对miR-150的功能研究主要集中在特异的组织或细胞，而对小鼠整体产生的影响，如对繁殖性能、血液学参数等是否会产生影响，国内外则鲜有报道。由于多种疾病如肿瘤、自身免疫病的发生或发展往往与全身生理或生化机能改变密切相关，为此，我们应用miR-150基因敲除小鼠(miR-150ko)，从生物整体水平和组织水平上探讨miR-150基因缺失对小鼠繁殖和血液细胞学及生化指标的影响，试图发现miR-150基因缺失可能会对何种器官和组织产生影响，从而可能引发某些相关疾病，为深入研究miR-150的功能提供参考依据。

1　材料与方法

1.1材料miR-150ko小鼠购自美国Jackson 实验室，对照C57BL/6J 小鼠购买于北京大学医学部实验动物科学部，许可证号为SCXK (京) 2011-0012。小鼠均饲养于北京大学医学部实验动物科学部屏障环境中，许可证号为SYXK (京) 2011-0039；小鼠饲喂SPF 级全价营养鼠料，由北京科澳协力饲料有限公司提供，许可证号为SCXK(京) 2014-0010。实验分为两组，共40只，8～10周miR-150ko 小鼠20只，雌雄各半，同周龄C57BL/6J小鼠20只，雌雄各半。

1.2方法

1.2.1miR-150ko小鼠基因型鉴定miR-150ko小鼠基因型PCR鉴定以鼠尾DNA为模版，引物分别为：上游：5′-CAAGGACAGGAACCCTTCAGCA-3′；下游：5′-CCATGATGCCTGGAAGACATTTC-3′。miR-150ko小鼠扩增产生长度为262 bp的DNA片段，对照C57BL/6J小鼠扩增产生长度为866 bp的DNA片段。

1.2.2 繁殖性能的测定70～80日龄miR-150ko小鼠种鼠和对照小鼠采用1∶1同质纯合子互交，各6对，观察小鼠窝产仔数和离乳率，用G&G 电子天平测定小鼠体重，绘制生长曲线。

1.2.3血液细胞学指标的测定小鼠眼眶静脉丛取全血20 μl加入3 ml血球稀释液中应用Nikon自动血球计数仪进行白细胞总数(WBC)、红细胞数(RBC)、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均血红蛋白量(MCH)、平均血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞体积(RDW)、血小板计数(PLT)、血小板比积(PCT)、平均血小板体积(MPV)、血小板平均分布宽度 (PDW)、淋巴细胞数(LYM)、中间细胞数(MID)、中性粒细胞数(GRN)、淋巴细胞百分比(LYM%)、中间细胞百分比(MID%)、中性粒细胞百分比(GRN%)的测定。

1.2.4血液生化指标的测定小鼠眼眶静脉丛取血，离心分离血清，应用Mindray BS-180全自动生化分析仪测定血清丙氨酸氨基转移酶(GPT)、天门冬氨酸氨基转移酶(GOT)、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、总蛋白质(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA-J)、尿酸(UA)、尿素(UREA)、肌酸激酶(CK)、羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)、肌酸激酶Mb型(CK-MB)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。测定试剂盒均购自Mindray公司。

2　结果

2.1miR-150ko小鼠基因鉴定miR-150ko鼠尾DNA 经PCR扩增产生262 bp片段，对照C57BL/6J小鼠产生866 bp片段，miR-150ko小鼠基因鉴定正确(图1)。

2.2miR-150ko小鼠繁殖情况miR-150ko小鼠窝产仔数和离乳率与C57BL/6J正常对照小鼠相比均显著降低，具有统计学差异(P<0.05)，见表1。

2.3miR-150ko小鼠哺乳期仔鼠体重增长情况图2结果显示，miR-150ko小鼠与C57BL/6J正常对照小鼠相比在哺乳期体重并无显著性差异。

2.4miR-150ko小鼠离乳后体重增长情况图3结果显示，miR-150ko小鼠与C57BL/6J正常对照小鼠相比离乳后体重并无显著性差异。

2.5 miR-150ko小鼠血液细胞学参数的变化miR-150ko 小鼠白细胞计数 (P<0.05)、中间细胞数(P<0.05)、中性粒细胞数(P<0.05)、中间细胞百分比(P<0.01)、中性粒细胞百分比(P<0.01)与C57BL/6J对照小鼠相比显著升高，而血小板计数(P<0.05)、血小板比积(P<0.05)、淋巴细胞百分比(P<0.01)与C57BL/6J小鼠相比则显著降低(表2)。

图1　PCR 鉴定miR-150ko小鼠基因型Fig.1　PCR genotyping of miR-150ko miceNote: 1.miR150ko;2.C57BL/6J control.

GroupsNumberoflittersWeaningrate(%)miR-150ko4.5±2.51)56.0±5.51)C57BL/6J6.8±1.492.3±4.2

Note：1)P<0.05，compared with control mice.

图2　miR-150ko小鼠哺乳期仔鼠体重增长情况Fig.2　Weight growth curve of miR-150ko mice during lactation

图3　miR-150ko小鼠离乳后体重增长情况Fig.3　Weight growth curve of miR-150ko mice after weaning

2.6miR-150ko小鼠血清生化参数的变化miR-150ko小鼠血清葡萄糖水平(P<0.01)和总胆固醇水平(P<0.05)与C57BL/6J对照小鼠相比显著升高，而其他各项血清指标未见显著性差异(表3)。

3　讨论

miR-150是一个长度为22个核苷酸的单链小分子RNA，定位于人类染色体19q13.33，在淋巴结和脾脏中显著高表达，并参与免疫系统和造血系统发生、胚胎发育以及干细胞分化的调节，其异常表达会导致免疫系统及造血系统疾病的发生[6]。若miR-150缺失，Zhou等[7]最早发现miR-150缺失导致B细胞异常扩增，体液免疫应答显著增强，但对CD4和CD8传统T细胞的发育和功能没有影响，表明miR-150在不同淋巴细胞发育和功能中发挥不同的作用。本研究中我们应用miR-150ko小鼠，通过观测其窝产仔数和离乳率，探讨miR-150缺失是否会对小鼠的繁殖性能产生影响，结果显示miR-150ko小鼠第一胎、第三胎和第四胎的窝产仔数和离乳率与正常对照小鼠相比均显著下降。目前关于miR-150敲除影响小鼠窝产仔数和离乳率的机制仍不清楚，以往研究表明，某些特异microRNAs如miR-132、miR-212、miR-224、miR-145在促性腺激素的作用下发生表达变化，进而通过调控卵巢粒层细胞的增殖或凋亡影响繁殖[8-10]。最近研究发现，miR-150在小鼠卵巢发育和卵泡形成过程中发生表达变化，因此，miR-150是否也通过相似的机制影响小鼠的繁殖尚需在以后实验中进一步探讨[11]。总之，本研究数据证明miR-150缺失可能会影响到胚胎的发育。但是对哺乳期体重和离乳之后的体重增长情况观察，miR-150ko小鼠的生长状况与正常对照小鼠未见显著性差异。

ParametersmiR-150koC57BL/6JWBC(109L-1)15.0±3.81)9.5±2.9RBC(1012L-1)8.9±0.39.7±0.6HGB(g/L)145.0±4.0150.0±3.5HCT(%)44.3±1.745.5±1.9MCV(fl)49.4±0.446.8±1.7MCH(pg)16.0±0.215.4±0.7MCHC(g/L)327.0±6.0333.0±3.0RDW(%)14.2±0.415.3±2.0PLT(109L-1)317.7±29.61)420.3±55.9PCT(%)0.11±0.011)0.15±0.01MPV(%)3.6±0.23.7±0.2PDW(%)13.8±0.413.3±1.5LYM(109L-1)8.9±2.47.5±2.3MID(109L-1)1.6±0.31)0.8±0.3GRN(109L-1)3.6±1.21)1.1±0.5LYM(%)63.4±1.51)79.6±4.0MID(%)11.4±1.01)8.2±0.3GRN(%)25.3±1.51)12.2±3.9

Note：1)P<0.05，compared with control mice.

IndexesmiR-150koC57BL/6JGPT(U/L)50.8±15.041.0±12.2GOT(U/L)92.5±5.488.6±16.2GLU(mmol/L)8.6±1.11)5.0±0.3TC(mmol/L)2.6±0.11)1.7±0.4TG(mmol/L)0.9±0.10.9±0.1TP(g/L)58.2±3.256.4±2.1ALB(g/L)34.4±1.631.7±1.5CREA-J(μmol/L)48.2±6.163.0±9.3UA(μmol/L)68.1±17.065.7±4.9UREA(mmol/L)7.2±1.09.5±1.2CK(U/L)168.6±21.8186.7±69.8α-HBDH(U/L)109.5±1.9183.7±26.7CK-MB(U/L)12.1±1.621.4±5.4HDL-C(mmol/L)2.2±0.31.6±0.3LDL-C(mmol/L)0.4±0.10.3±0.1

Note：1)P<0.05，compared with control mice.

已有一些关于miR-150在免疫系统中的作用并参与炎症反应的报道。如Trifari等[12]的研究表明，miR-150参与了对细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTLs)生成的调节，其活性能被IL-2、炎症反应和抗原刺激等许多因素调节。又如在miR-150敲除小鼠的骨髓内，NK细胞的发育和成熟严重受阻。相应地，过表达miR-150则能促进NK细胞的发育成熟[13]。本研究显示miR-150ko小鼠的血常规中，miR-150ko小鼠白细胞计数、中间细胞数、中性粒细胞数、中间细胞百分比、中性粒细胞百分比与C57BL/6J小鼠相比显著升高，表明miR-150缺失的小鼠呈现炎性反应的状态。

miRNAs在造血发育过程中的作用是目前miRNA研究的一个热点。Barroga等[14]研究发现，miR-150能影响巨核-红系祖细胞(Megakaryocyte er-ythrocyte progenitors,MEPs)的最终分化命运。同时Edelstein 等[15]研究发现miR-150促进后期巨核细胞分化和血小板生成。在本研究中发现miR-150ko小鼠血小板计数较正常对照小鼠显著降低，亦证明miR-150影响到血小板的生成。

从血清生化指标来看，miR-150ko小鼠的血糖值要显著高于正常对照小鼠，表明miR-150缺失可能会促进糖尿病的发生。关于miR-150与糖尿病之间的相关性，也有研究报道。如崔云霞[16]的研究在糖尿病大鼠模型中发现miR-150低表达；郑全辉等[17]发现miR-150缺失增强小鼠NKT细胞IFN-γ产生并促进小鼠Ⅰ型糖尿病的发生。另外，我们还观察到miR-150ko小鼠血清总胆固醇较正常对照小鼠显著升高，这一发现提示miR-150或许与动脉粥样硬化等心血管系统疾病的发生有一定的相关性，有待进一步探讨和证实。

综上所述，miR-150缺失对小鼠的繁殖性能、血液细胞学中与炎症有关的指标及血小板产生影响，同时有加速糖尿病发生的可能性。

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[收稿2015-12-15修回2016-02-10]

(编辑张晓舟)

miR-150 deletion affects breeding and hematologic parameters of mice

ZHENG Quan-Hui,TIAN Feng,LI Wen-Ting,ZHANG Qiu-Ru,WANG Shan.

Hebei Key Laboratory for Chronic Diseases，Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases,School of Basic Medical Sciences,North China University of Science and Technology,Tangshan 063000，China

Objective:To investigate the effect of miR-150 gene deletion on the breeding and hematologic parameters of mice.Methods: The nest litter size,wean rate and weight changes of miR-150 knock out (miR-150ko) and C57BL/6J mice were compared.The hematology indexes were analyzed by automated blood cell counter,the serum biochemical parameters were analyzed by automatic biochemical analyzer.Results: The nest litter size and wean rate of miR-150ko mice were significantly decreased compared with that of C57BL/6J mice.The number of total white blood cells,intermediate cells,neutrophils,and the percentage of neutrophils and intermediate cells were significantly increased in miR-150ko mice compared with that of C57BL/6J mice.However,the number and percentage of platelets and lymphocytes decreased significantly in miR-150ko mice.In addition,the levels of serum glucose and TC were increased significantly in miR-150ko mice compared with that of C57BL/6J mice.Conclusion: miR-150 gene deletion impairs the breeding and has complex impact on hematologic parameters of mice.

miR-150;Gene deletion;Mice;Breeding;Hematology

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.001

①本文受国家自然科学基金面上项目(81373111)和河北省自然科学基金资助项目(H2013209019)资助。

郑全辉(1973年-)，男，博士，副教授，主要从事免疫调节细胞发育和功能的分子调控机制研究，E-mail: zquanhui@ yahoo.com。

R34

A

1000-484X(2016)10-1409-04

②并列第一作者，北京大学医学部实验动物科学部，北京100191。