基于石墨烯/离子液体构建免疫传感器快速测定食品中黄曲霉毒素B1

王瑞鑫，冯亚净，李书国

（河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018）

基于石墨烯/离子液体构建免疫传感器快速测定食品中黄曲霉毒素B1

王瑞鑫，冯亚净，李书国*

（河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018）

采用壳聚糖、石墨烯和1-丁基-3-甲基咪唑基四氟硼酸盐复合膜修饰玻碳电极，包埋固定黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）抗体，构建了一种免疫传感器，用于快速测定食品中的AFB1。在pH值为7.0含1 mmol/L K3［Fe（CN）6］和0.1 mmol/L KCl的磷酸盐缓冲溶液中，基于AFB1抗体与抗原之间的特异性免疫反应，以K3［Fe（CN）6］为探针，运用循环伏安法和差分脉冲伏安法研究免疫反应对传感器响应电流的影响。在优化实验条件下，免疫传感器峰电流的降低值随溶液中AFB1质量浓度对数的增大而增大，且二者在0.1～8.1 ng/mL范围内呈线性关系，其检出限为0.04 ng/mL（RSN=3）。该免疫传感器的稳定性和重复性较好，利用该法对花生和玉米油样品中AFB1进行检测，回收率为94.73%～104.41%，检测结果与高效液相色谱法基本一致，用于食品中AFB1的快速检测是可行的。

免疫传感器；黄曲霉毒素B1；石墨烯；离子液体；食品安全快速检测

黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类化学结构相类似的毒性物质［1］。黄曲霉毒素均为二氢呋喃香豆素的衍生物，常见的有黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、AFG1、AFM1等，其中以AFB1的毒性和致癌性最强［2-4］。多数国家严格控制食品和农产品中AFB1的含量。我国GB 2761—2011《食品中真菌毒素限量》规定谷物、油脂及其制品中限量标准为20 μg/kg，欧盟国家的限量标准最严格，在花生、坚果、干果和谷物中为2.0 μg/kg［5-7］。建立检测用时短、准确性高和灵敏度好的AFB1检测方法重大意义。

目前，AFB1的检测方法主要有薄层层析法［8-10］、高效液相色谱法［11-14］、液相色谱-质谱法［15-18］、酶联免疫吸附法［19-22］等。上述方法各有优劣，薄层层析法操作简单、成本低，但存在灵敏度低和对环境污染系数大等问题；高效液相色谱法和气相色谱-质谱法灵敏度高、精确度好，但存在操作繁琐和仪器昂贵等缺点；酶联免疫吸附法检测速度快，但检测精度不足。免疫传感器法通过将抗原/抗体间的免疫反应转换为电信号，依据目标物不同质量浓度条件下信号的规律性变化完成检测，随着特异性抗体不断地研发，凭借其检测灵敏度高和特异性好的优势发展迅速，也成为检测AFB1的一种方法［22-25］。

本实验以AFB1为研究对象，采用壳聚糖（chitosan，CS）/石墨烯（graphene，GS）/1-丁基-3-甲基咪唑基四氟硼酸盐（1-butyl-3-methyl imidazolium tetrafluoroborate，IL）复合膜（CS/GS/IL）修饰玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE），利用成膜性极好的壳聚糖分散具有大比表面积的石墨烯和良好生物兼容性的离子液体固定AFB1抗体（afl atoxin B1antibody，anti-AFB1），制备了一种无标记电流型免疫传感器。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

花生、玉米油购自石家庄市某农贸市场。

壳聚糖（脱乙酰度≥90.0%） 北京索莱宝科技有限公司；石墨烯（纯度＞99%） 北京德科岛金科技有限公司；对氨基苯甲酸（分析纯）、N-羟基琥珀酰亚胺（98%）、1-乙基（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（98%）、1-丁基-3-甲基咪唑基四氟硼酸盐（97%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；AFB1、AFM1美国Sigma公司；AFB1抗体 深圳芬德生物技术有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（96%）上海翊圣生物科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺（分析纯） 天津市达森化工产品销售有限公司。

1.2仪器与设备

LK98BⅡ型微机电化学分析系统、三电极系统（3 mm玻碳圆盘电极为工作电极、铂丝电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极） 天津兰力科化学电子高技术有限公司；LC-10A型高效液相色谱仪 日本岛津公司；FA 2204型电子分析天平 上海菁海仪器有限公司；KQ 2200型超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司；TGL-10B型高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；GZX-9070 MBE型电热鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；HH-S6型恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1CS/GS/IL修饰液的制备

将0.01 g CS溶于10 mL乙酸（体积分数1%）溶液中，制得质量浓度为1 g/L的CS透明溶液，于4 ℃条件下贮存。在10 mL N,N-二甲基甲酰胺中加入0.01 g GS，超声处理5 min，制得均匀分散的GS悬浮液。取5 mL GS悬浮液加入5 mL CS溶液中，超声处理15 min，使GS均匀地分散在CS溶液中，得到CS/GS悬浮液。取200 μL IL加入上述CS/GS悬浮液，超声处理30 min，使IL均匀分散在CS/GS混合液中，得到CS/GS/IL修饰液，于4 ℃贮存，备用。

1.3.2电化学免疫传感器的制备

将GCE用Al2O3粉末（粒径0.05 μm）打磨抛光，至电极表面成光滑镜面，再依次于浓硝酸-水（1∶1，V/V），丙酮和去离子水中各超声处理4 min，氮气吹干，备用。

图1　GCE/CS/GS/IL/anti-AFB1免疫传感器的制备及免疫过程Fig.1　Preparation and immune reaction of GCE/CS/GS/IL/anti-AFB1immunosensor

免疫传感器的制备过程见图1。利用三电极系统，即经预处理的GCE为工作电极、Ag/AgCl为参比电极、铂丝电极为辅助电极，在-1.5～1.0 V电位区间内，以50 mV/s的扫速在新配制的5 mmol/L对氨基苯甲酸溶液中进行循环伏安扫描15 圈。冲洗GCE表面，滴加5 μL新配制的1-乙基（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（ethyl（1-3-dimethyl amino propyl） carbon 2 imine hydrochloride，EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxy succinimide，NHS）的混合液（NHS为100 mmol/L，EDC为400 mmol/L），活化处理2 h。在GCE表面滴加5 μL CS/GS/IL，通过CS中氨基与GCE表面活化后的羧基发生酸胺缩合反应的方式固定CS/GS/IL。室温条件下晾干，在GCE表面滴加5 μL anti-AFB1，37 ℃条件下孵育2 h，anti-AFB1经CS中氨基固定于GCE。最后在GCE表面滴加5 μL 1% BSA的磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4），4 ℃条件下封闭30 min，以消除非特异性吸附，得到GCE/CS/GS/IL/anti-AFB1免疫传感器，于4 ℃条件下保存备用。

1.3.3免疫传感器法

在CS/GS/IL/anti-AFB1修饰的玻碳电极表面分别滴涂不同质量浓度梯度（0.1～8.1 ng/mL）的AFB1标准溶液，在37 ℃条件下温育30 min。采用三电极系统（GCE/CS/ GS/IL/anti-AFB1为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极），于1.0 mmol/L K3［Fe（CN）6］+ 0.1 mol/L KCl+0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer solution，PBS）（pH 7.0）进行电化学表征和检测分析。运用循环伏安法（电压：-0.2～0.6 V，扫描速率：50 mV/s）对于免疫传感器的制备作电化学表征，运用差分脉冲伏安（differential pulse voltammetry，DPV）法（电位：-0.2～0.6 V）测定并记录不同质量浓度AFB1峰电流值Ip，分析Ip的变化值与相对应AFB1质量浓度对数的关系，并做标准曲线。

1.3.4样品中AFB1的测定

1.3.4.1样品前处理

分别取10 g花生（粒度小于2 mm）、玉米油样品，置于150 mL锥形瓶中，加入50 mL甲醇-水（80∶20，V/V，含10 g/L NaCl）溶液，超声处理30 min，充分溶解。样品提取液以5 000 r/min离心5 min，取上清液1 mL加入9 mL水中进行稀释，再经0.22 μm有机相滤膜过滤，备用。

1.3.4.2免疫传感器测定

在制备好的免疫传感器上滴加2 μL处理好的样品提取液，在37 ℃条件下孵育30 min，利用DPV法测定。每个样品测定3 次，取3 次测定电流值的平均值作为该样品的电流值，将该电流值代入1.3.3节中得出的电流值的变化与AFB1质量浓度对数的线性回归方程，计算样品中AFB1的量。

1.3.4.3高效液相色谱法测定

色谱条件：色谱柱：Wo n d a C r a c t O D S-2（4.6 mm×250 mm，5 μm）；检测器：SPD-10AVP Plus紫外-可见双波长检测器；流动相：甲醇-水（45∶55，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL；波长：360 nm。

称取25 mg AFB1标准品，用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，作为储备液保存于4 ℃条件下。使用前依据需求配成相应质量浓度梯度的标准溶液，取20 μL标准溶液进样，记录其高效液相色谱的图谱，根据所得峰面积与对应的AFB1质量浓度绘制标准曲线。分别取上述处理好的花生、玉米油样品提取液20 μL，进行高效液相色谱检测，依据上述标准曲线计算中AFB1质量浓度，并与免疫传感器检测方法作对比。

1.4数据统计分析方法

以上测定均为3 组平行实验，取3 组平均值。运用SPASS 18.0软件进行数据统计分析，采用单因素方差分析进行显著性差异分析（P＜0.05），实验的数据图利用OriginLab Origin Pro v9.0软件绘制。

2　结果与分析

2.1CS/GS/IL修饰电极的电化学表征

图2　不同修饰电极的循环伏安图Fig.2　Cyclic voltammograms of different electrodes

在1.0 mmol/L K3［Fe（CN）6］+0.1 mol/L KCl+ 0.2 mol/L PBS（pH 7.0）的测试底液中，采用循环伏安（cyclic voltammetry，CV）法对裸玻碳（a）、GCE/CS（b）、GCE/CS/GS（c）和GCE/CS/GS/IL（d）进行表征（图2）。在裸GCE上有一对较好的氧化还原峰。修饰CS后，氧化还原峰电流减小，修饰CS/GS后，氧化还原峰电流明显增大，GS的引入明显提高了GCE的电流响应，这是由于GS粒子经CS/GS固定在GCE表面，具有突出电学性能的GS粒子相当于纳米尺寸的微电极，可作为电子与电极之间电子传递的微通道。当电极的表面修饰了CS/GS/IL后，其氧化还原峰的电流进一步增大。

2.2免疫反应的电化学表征

当在GCE/CS/GS/IL表面滴加anti-AFB1以后，氧化还原峰的电流减少（图3），这是由于抗体作为蛋白质的绝缘性阻碍电子的传递，这就说明anti-AFB1已经成功固定在电极表面上。在经BSA封闭后的GCE/CS/GS/IL/anti-AFB1表面滴加AFB1标准溶液后，其峰电流进一步降低，表明anti-AFB1和AFB1已经成功结合进行特异性免疫反应。

图3　修饰电极免疫前后的循环伏安图Fig.3　Cyclic voltammograms of the electrodes before and after immuno-modification

2.3实验条件的优化

2.3.1修饰液的配比和用量对免疫传感器的影响

修饰液的配比会对免疫传感器的造成影响，按照CS和GS的体积比为0.5∶1、1∶1、1.5∶1各配制CS/GS的混合液5 mL，并添加100 μL IL，分别取5 μL修饰经处理的GCE，运用CV测定其电流大小，当CS和GS的体积比为1∶1时，电流最大，因此，选择二者体积比为1∶1，并添加50 μL IL作为修饰液的配比。CS/GS/IL修饰液的用量会影响电子的传递，分别将1、2、3、4、5、6 μL的CS/GS/IL复合物滴涂在经电聚合处理的GCE上，采用CV测定电流的大小。如图4所示，氧化峰电流一开始逐渐增大，当用量为5 μL时，电流最大。然后随CS/GS/IL用量的增加，电流逐渐减小，综合考虑选择修饰液的用量为5 μL。

图4　修饰液用量对免疫传感器电流的影响Fig.4　Effect of modified composite quantity on the response current of the immunosensor

2.3.2测试底液pH值对免疫传感器的影响

图5　pH值对免疫传感器DPV峰电流的影响Fig.5　Effect of pH on the DPV peak current of the immunosensor

如图5所示，在5.8～7.0范围内峰电流随pH值的增大而增大，在pH值为7.0时达到最大，在7.0～7.8范围内峰电流随pH值的增大而减小，这可能是因为在酸性或者碱性条件下，抗体中部分基团质子化或解离导致抗体产生变性。因此，选择电解质溶液的pH值为7.0。

2.3.3温育时间与温度对免疫传感器的影响

图6　温育时间（A）和温度（B）对免疫传感器DPV峰电流的影响Fig.6　Effect of incubation time and temperature on the DPV peak current of the immunosensor

在GCE/CS/GS/IL/anti-AFB1表面滴加2 μL AFB1标准溶液，依次延长时间，采用DPV测定响应电流。如图6A所示，在10～30 min范围内峰电流随时间的延长而增大，说明抗原与抗体反应需要一定时间，才能结合并形成稳定的免疫产物，当反应达到30 min后，峰电流的变化较小，表明固定的anti-AFB1的AFB1的结合达到相对饱和，所以选取30 min为优化温育时间。在一定温度范围内，升温能加速形成免疫产物，但抗体失活的可能性也增大。所以在优化温育时间的条件下，探究温育温度在17～42 ℃范围内对免疫反应的影响。如图6B所示，在17～37 ℃范围内，电流随温度升高而增大，在37 ℃时最大，高于37 ℃后，电流值减少，这是由于高温破坏了免疫复合层，所以选取37 ℃为优化温育温度。

2.4免疫传感器对AFB1的差分脉冲检测结果

配制系列质量浓度的AFB1标准溶液，按照1.3.3节的方法测得不同质量浓度标准溶液的响应电流值，以所测峰电流与质量浓度为0时峰电流的差值为纵坐标，AFB1标准溶液质量浓度的对数为横坐标，绘制AFB1的标准曲线。如图7所示，在AFB1质量浓度范围为0.1～8.1 ng/mL时免疫反应电流差值ΔIp随AFB1质量浓度的增大而增大，且ΔIp值与lgCAFB1之间的关系满足线性关系方程：ΔIp= 4.659lgCAFB1+7.205，线性相关系数R² = 0.999，其检出限为0.04 ng/mL（RSN=3）。Zhang Songbai等［26］采用邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯功能化的多壁碳纳米管和钯金纳米颗粒构建AFB1免疫传感器，线性范围为0.05～25 ng/mL，其检出限为0.03 ng/mL；Ma Haihua等［27］基于壳聚糖和纳米金粒子构建AFB1免疫传感器检测检测玉米中的AFB1，检测范围为0.01～10 μmol/L，检出限为2.02 ng/mL。孙秀兰等［28］采用溶胶凝胶法固定AFB1抗体，制备了一种AFB1免疫传感器，其检出限为0.1 ng/mL。由此可见，本实验构建的免疫传感器具有较好的灵敏度，可作为一种快速测定AFB1的方法。

图7　AFB1质量浓度对免疫传感器响应电流的影响Fig.7　Effect of AFB1concentration on the DPV peak current of the immunosensor

2.5免疫传感器的特异性、稳定性和重复性

在免疫传感器表面分别滴加2 μL AFB1标准溶液、2 μL AFB1和AFM1标准溶液、其中AFB1和AFM1的质量浓度均为8 ng/mL，相同条件下处理后测定差分脉冲响应电流值。在加入干扰物（AFM1）的条件下，电流响应的变化不超过5.42%，说明该免疫传感器特异性较好。将制备好的免疫传感器连续扫描15 圈，电流响应仅下降3.85%，将制备好的免疫传感器置于4 ℃条件下密闭保存，每3 d在相同条件下进行DPV扫描，9 d后的电流响应值为初始电流响应值的92.4%，表明该免疫传感器的稳定性较好。分别制备同一批次3 支免疫传感器和3 个批次（每个批次2 支）的免疫传感器，进行AFB1检测，同一批次的电流变化率不超过5.15%，不同批次的电流变化率不超过5.89%，表明该传感器重复性较好。

2.6样品中AFB1的测定及加标回收实验结果

按照1.3.4.1节的方法处理样品，得到样品提取液，分别采用免疫传感器法和高效液相色谱法检测花生、玉米油两种样品中AFB1含量，并进行加标回收实验，按照1.4节的方法，计算其平均值和相对标准偏差，结果如表1所示，该法对花生和玉米油样品中AFB1的进行检测，回收率为94.73%～104.41%，检测结果与高效液相色谱法基本一致，免疫传感器法用于食品中AFB1的检测快捷、方便、可行。

表1　样品中AFB1含量测定的结果Table1　Analytical results obtained for the determination of AFB in samples

3　结 论

利用壳聚糖-石墨烯掺杂1-丁基-3-甲基咪唑基四氟硼酸盐作为电极修饰材料，制备了一种无标记的电流型免疫传感器。该免疫传感器利用具有成膜性极好的壳聚糖大分子、具有高比表面积的石墨烯和良好生物兼容性的离子液体来固定黄曲霉毒素抗体，石墨烯优良的导电性能和特殊的结构为免疫传感器表面电子传递提供更多通道，离子液体的引入进一步改善了免疫传感器表面的导电能力和有利于保持生物分子的活性，3 种材料组成的复合膜提高了免疫传感器的稳定性和灵敏度。此外，该传感器制作过程简单、灵敏度高、稳定性和重复性好，可以实现对AFB1的快速、简便、灵敏检测，在食品检测方面具有潜在的应用价值。

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［28］ 孙秀兰, 汪忠云, 方银军, 等. 溶胶凝胶法固定抗体制备黄曲霉毒素免疫传感器［J］. 分析化学, 2010, 38（2）： 245-248. DOI：10.3724/ SP.J.1096.2010.00245.

An Electrochemical Immunosensor for Rapid Determination of Aflatoxin B1in Foods Based on Graphene and Ionic Liquid

WANG Ruixin, FENG Yajing, LI Shuguo*
（College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China）

An electrochemical immunosensor for the rapid determination of aflatoxin B1（AFB1） in foods has been fabricated by employing chitosan, graphene and 1-butyl-3-methyl imidazolium tetrafluoroborate composite film to immobilize AFB1antibody onto the surface of glassy carbon electrode. Based on the specific immune reaction between AFB1antibody and antigen, the effects of immune response on the response current of the immunosensor were investigated by cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry using K3［Fe（CN）6］ as the probe in phosphate buffer solution （pH 7.0） with 1 mmol/L K3［Fe（CN）6］ and 0.1 KCl. Under the optimized experimental conditions, the reduction in the peak current of the immunosensor increased with the increase in the logarithm of the concentration of AFB1in solution, showing a linear relationship in the AFB1concentration range of 0.1-8.1 ng/mL with limit of detection （LOD） of 0.04 ng/mL （RSN= 3）. Excellent stability and repeatability of the prepared immunosensor were observed under the selected condition. The recovery rate of AFB1in peanut and corn oil samples was in the range of 94.73%-104.41%. The results from this method well agreed with those obtained by high performance liquid chromatography method, and so it is practicable for the rapid determination of AFB1in food.

immunosensor； aflatoxin B1（AFB1）； graphene； ionic liquid； rapid detection in food safety

10.7506/spkx1002-6630-201620020

TS207.5

A

1002-6630（2016）20-0120-06

王瑞鑫, 冯亚净, 李书国. 基于石墨烯/离子液体构建免疫传感器快速测定食品中黄曲霉毒素B1［J］. 食品科学, 2016, 37（20）： 120-125. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620020. http：//www.spkx.net.cn

WANG Ruixin, FENG Yajing, LI Shuguo. An electrochemical immunosensor for rapid determination of aflatoxin B1in foods based on graphene and ionic liquid［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 120-125. （in Chinese with English abstract）

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620020. http：//www.spkx.net.cn

2016-03-07

国家自然科学基金面上项目（20876165）；河北省食品药品安全科技项目计划项目（PT2014027）

王瑞鑫（1992—），男，硕士研究生，研究方向为食品科学与安全。E-mail：245559416@qq.com

李书国（1969—），男，教授，博士，研究方向为粮油食品安全技术。E-mail：shuguolee@126.com