高分子材料超声微泡的应用研究

于姣姣（综述）　赵 云（审校）

高分子材料超声微泡的应用研究

于姣姣（综述）赵 云（审校）

超声检查；造影剂；聚合物；综述

自1968年Gramiak等［1］首次报道将自制微泡应用于临床超声心动图检查以来，超声微泡的制备技术日益革新、应用研究不断扩大。目前所用超声微泡均由外膜和其包裹的气体所构成，直径均小于8 μm，可通过肺毛细血管循环，在超声作用下被激发，产生较强的回波反射性能，从而增强组织回声，提高组织显影的清晰度。此外，微泡可作为一种靶向基因或药物治疗的载体，减小对周围正常组织的损伤，并增强肿瘤治疗效果。超声微泡主要以非离子表面活性剂、蛋白质类、脂类、高分子多聚物等为外膜包裹氟碳气体。蛋白质类是最早的微泡外膜材料，近年来，以SonoVue为代表的脂质微泡应用较为广泛，微泡外膜的稳定性及临床应用的高效和安全性仍在探索优化中。高分子材料超声微泡尚未应用于临床，但随着高分子化学的发展，以高分子材料为膜的超声微泡具有外壳坚硬、抗压性强、稳定性高、并能在体内自然降解、减少药物对人体的毒副反应等特点，成为研究的热点［2］。高分子材料超声微泡载药载基因及良好的显影优势，在疾病的早期定性、定位诊断及靶向治疗的研究中受到更多的关注。本文拟对高分子材料超声微泡的制备、载药载基因及对疾病的诊疗做一综述，以使更多学者进一步了解高分子材料超声微泡的现状及发展趋势，从而加快其应用于临床。

1　高分子材料超声微泡制备技术

高分子材料又称为聚合物材料，是以高分子化合物为基体，并配有其他添加剂组成的材料，其作为成膜物质的分子量一般在5000以上。目前已应用的高分子材料有乳酸羟基乙酸共聚物（PLGA）、多聚糖、聚己内酯、聚乙烯乙二醇、聚乳糖等，其中PLGA是经美国食品药品监督管理局（FDA）批准而应用较为广泛的一类超声微泡材料［3-4］。根据高分子聚合物及药物的不同性质，其超声微泡的制备方法也有很多，目前以采用改良双乳剂挥发法与冷冻干燥技术相结合的方法较多见［3］。制备时将高分子多聚物溶解于有机溶剂中，加入一定的水溶液，通过机械搅拌和超声波振荡形成油包水初乳，再加入含稳定剂的水溶液中，通过匀质机的乳化作用形成复乳，然后加入相关溶液，在磁力搅拌机作用下使有机溶剂挥发，再利用真空冷冻干燥技术除去水分，加入氟碳气体即可得到高分子材料包裹气体的超声微泡。

尽管上述制备技术对高分子材料超声微泡，尚未针对临床进行工业化生产，但相对于蛋白质类微泡常使用的乳化固化法及以表面活性剂和磷脂为成膜材料的微泡曾采用的声振空化法，克服了上述方法不能很好地控制微泡的声学性能和理化性质这一缺点，而且该制备方法与常规微泡造影剂不同，更适于载药或载基因。近年来，改变高分子材料的种类，采用不同聚合条件，调节制备过程中的各项性能参数，以及利用微泡携带不同药物或基因，已成为超声微泡造影剂研究的主要方向。

2　高分子材料超声微泡载药或载基因制备

近年来，高分子材料作为超声微泡包膜用于载药或载基因方面的研究较多。Hou等［5］以聚乳酸为外膜，包裹10-羟基喜树碱，成功制得载药微泡，药物包封率达62.2%，载药量达1.69%，其体外试验中，超声联合载药微泡提高细胞膜的通透性，增强细胞内药物吸收。Teng等［6］选择mPEGPLGA-PLL为成膜材料包载乳腺癌耐药蛋白-siRNA制得纳米微泡，基因包封率高于98%，在体外试验中，利用超声靶向破坏微泡，siRNA得到有效转染，与裸siRNA相比，相应蛋白表达显著下调。Deng等［7］制备以PLGA为外膜包裹阿霉素的纳米微泡，电镜下微泡分布均匀，表面光滑，平均粒径为（270±3）nm。在体外试验中，该载药微泡比单独使用阿霉素对HeLa细胞生长表现出更大的抑制作用。Chen等［8］设计了天然高分子聚合物环糊精和低分子量聚乙烯亚胺（PEI）的纳米载体，包封反义寡聚核苷酸的Bcl-xl，转染人肺腺癌细胞，结果表明，该载体有效抑制Bcl-xl mRNA和蛋白质的表达，诱导细胞凋亡，并优于分枝状PEI（25 kD）和脂质体2000。Luo等［9］将两亲性的高分子聚合物合成纳米微泡，并在表面连接乳铁蛋白，通过体内外实验超声成像的评估，与SonoVue微泡相比对肿瘤的显影效果更强、更持久。

高分子材料作为微泡的包膜具有较高的负载能力和良好的生物相容性。此外，构成共聚物两嵌段的疏水端和亲水端结构简单，易于改造。共聚物疏水端与相容性较高的药物结合，可有效提高微泡载药量和稳定性，亲水端通过避免网状内皮系统对微泡的识别，使其在体内的半衰期延长，可连接水溶性物质和靶向基因。因此，高分子材料微泡更适宜作为基因或药物的载体。高分子超声微泡携带药物或基因的方式主要存在以下几种（图1）［10］：①基因或药物附着于微泡表面；②基因或药物直接作为微泡外膜材料的成分；③基因或药物嵌入双分子层微泡的内外膜之间；④基因或药物包裹在微泡内部；⑤利用静电相互作用，基因或药物被非共价结合至微泡表面。超声设备参数与微泡相关特性参数的设定、药物的溶解性及药物或基因与微泡的连接方式均可能影响微泡携药能力及基因转染效率。目前，高分子材料微泡在载药载基因方面的研究与临床应用并不如脂质微泡广泛，但是脂质微泡的单层壳膜载药能力有限，常难以达到肿瘤治疗所需的有效剂量，高分子聚合物可以通过调节其聚合比例改变微泡的直径及释放速度，载药量有所提高，且更易制得纳米级微泡，同时高分子材料易进行表面修饰，携带特异性抗体或基因，其靶向性更强，在临床应用中具有更广阔的前景。

图1　微泡携带药物或基因的几种方式。图片摘自参考文献［10］

3　高分子材料超声微泡诊断研究

超声微泡通过静脉注射后，可随体内血液循环到达各组织器官，因内含气体易于压缩和膨胀，在超声场下产生较强的回波反射性能，可以显著增强组织回声及医学超声检测信号。早期研究发现，激活的单核细胞和中性粒细胞在黏附吞噬微泡以后，微泡仍然完好无损，且可以保持超声声学特性不变，因此可以通过超声微泡显影发现炎症的发生部位［11］。Wang等［12］已使用P和E选择素靶向超声微泡，在小鼠急性结肠炎模型中对炎症水平进行检测和定量。Schumann等［13］研究发现微泡表面结合特异性寡肽，可识别血小板糖蛋白IIb/IIIa受体，活化连接位点，黏附在新鲜血栓表面使血栓显影，提高血栓检出率。此后，有较多学者对血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）这一靶点进行研究。Bachawal等［14］将VEGFR2作为靶点与超声微泡结合，在小鼠乳腺癌中成像信号显著增加，提高了超声早期检测小鼠乳腺癌和乳腺导管原位癌的诊断准确率，并为女性早期乳腺癌的检测奠定了基础。Mancini等［15］的实验研究发现，携带抗VEGFR2单克隆抗体的靶向超声微泡可用于体内非侵入性的早期癌症的检测和量化，VEGFR2在小鼠甲状腺癌中的表达，并可以此来区分甲状腺结节的良恶性。

随着超声医学与现代分子生物学的交叉发展，在超声微泡表面结合特异性配体，通过体内配体与受体选择性的结合，使微泡到达特定部位增强显影，从而提高超声的诊断水平。常规微泡由于其直径范围易停留于血液系统而不穿过血管内皮组织间隙，对于血管内病变如炎症、血栓、新生血管等的成像有较大优势。在炎症发生过程中，组织异常表达某些标志分子，而将微泡表面耦连上能识别这些配体的受体，使微泡选择性地滞留于炎症病灶的局部，即可增强炎症部位的超声显像。形成血栓的血小板表面可表达较高浓度的糖蛋白IIb/IIIa受体，对微泡表面物质加以修饰或成分加以改变，可提高微泡与血栓的亲和力，使微泡到达血栓内部，同样能实现超声下血栓显像的增强。肿瘤新生血管过程中，血管内皮细胞表达大量黏附分子、生长因子、细胞因子等［16］，成为超声微泡的作用位点，从而增强肿瘤血管和组织的显影。纳米级微泡的出现，以其独特的尺寸和较高的穿透力，能通过血管进入肿瘤，以区分病变组织和正常组织，从而大大提高了超声对肿瘤诊断的准确性。尽管脂质微泡不必受严格条件控制，比蛋白类微泡更易连接其配体，比高分子材料微泡声学响应性更好，但高分子材料微泡稳定性更好，在体内显影时间更长，在疾病的诊断方面优势明显。

4　高分子材料超声微泡靶向治疗研究

在靶向超声造影技术发展中，越来越多的学者致力于超声微泡对肿瘤的靶向治疗，开发新的治疗靶点及药物等方面的研究。Rapoport等［17］制备PLLA-PEG为膜包裹紫杉醇的微泡，与吉西他滨联合用药，作用于接种过人胰腺癌MiaPaCa-2细胞（癌细胞经红色荧光蛋白标记）的小鼠，在1 MHz超声辐射下，其对胰腺癌治疗效果明显。Niu等［18］在抗肿瘤药物研究中，以PLGA微泡包封氧化铁纳米颗粒和化疗药物（阿霉素）制得多功能聚合物微泡（图2），并将接种过VX2肿瘤的家兔随机分为生理盐水对照组、空白微泡组、单独阿霉素组、空白微泡联合超声组、阿霉素联合超声组和多功能聚合物微泡联合超声组，通过组织学和免疫组化检查对其抗肿瘤作用进行评估发现，多功能聚合物微泡联合超声组中增殖指数、微血管密度和微淋巴管密度计数均较其他组显著降低，凋亡指数较其他组显著增高，表明超声微泡在介导化疗药物抗肿瘤治疗方面具有积极有效的作用。Sorace等［19］利用微泡携带紫杉醇注射于患乳腺癌的小鼠体内，超声辐射瘤体，发现化疗药物联合超声微泡抑制肿瘤生长并提高癌细胞死亡率。靶向超声微泡的治疗能够通过增加局部药物的吸收，提高患者对化疗的耐受性，从而降低化疗药物的剂量和全身毒性。Li等［20］研究发现，采用mPEG-PLGA-PLL三嵌段共聚物为材料的纳米微泡携带针对人VEGF的siRNA，并在表面连接相关配体，可识别在PC-3前列腺癌细胞中高表达的整合素αvβ3，利用超声靶向破坏微泡，能够使PC-3细胞中的VEGF表达下调，抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡，与对照组相比显示出较低的细胞毒性和较高的基因转染效率。Zhang等［21］以PLGA为材料包裹氨甲蝶呤制得纳米微泡，并将单克隆抗-HLA-G抗体连接于微泡表面，注射于患绒毛膜癌的裸雌鼠体内，高强度聚焦超声辐照后，发现从微泡内靶向释放氨甲蝶呤，作用于肿瘤细胞发生最严重的凝固性坏死、最低的增殖指数和最高的凋亡指数。高强度聚焦超声联合包载化疗药物的靶向微泡可以最大限度地治愈肿瘤和阻止肿瘤在高强度聚焦超声消融后复发或转移。微泡的特殊物理声学性质已成为用于高强度聚焦超声增效治疗肿瘤的研究热点［22］。

图2　包载化疗药物的多功能微泡的结构及其在超声介导下抗肿瘤治疗。图片摘自参考文献［18］

在诸多实验研究中，携带药物或基因的超声微泡造影剂到达靶组织或靶器官后，在超声波的照射下发生空化效应，当超声波能量达到一定强度时，微泡破裂，药物或基因被释放，在病灶局部浓度升高，达到体内定点释放和靶向治疗的目的［23］。此外，由于超声的空化效应，微泡在发生破裂时产生的高速微射流、高能冲击波和巨大切应力，能使细胞膜的通透性增强，内皮细胞间隙增大，更有利于药物的吸收和基因的转染。近年来，随着人类基因组及分子生物的发展，基因治疗将目的基因导入特定的组织或细胞并进行表达，以治疗因基因异常或缺陷所引起的疾病，在人类疾病的治疗上具有无可争议的前景，成为医学领域的研究热点。然而，裸露的基因治疗药物却存在以下缺点［24］：①易被核酸酶降解；②在血液中半衰期短，降解快；③缺乏靶向性，细胞吸收率低；④自身负电荷与细胞膜上的负电荷相互排斥，致使其通过细胞内吞作用入胞能力及逃离内涵体能力较差。上述缺点均影响基因治疗的效果。因此，需要寻求恰当的载体来携带基因治疗药物，以克服基因治疗过程中所遇到的问题，从而提高靶向治疗效果。病毒载体虽然转染率高，但其在体内存在的安全性问题受到高度关注［25-26］，大规模的生产也将很难实现。高分子材料微泡使药物释放时间及降解时间延长，并减少药物毒性及对组织的损伤，其作为基因或药物载体，在体内及体外实验中均表现出良好的靶向释药能力及药物治疗作用［27］。近来，光热治疗（利用光热转换试剂从吸收的光产生的热能有效地治疗各种恶性疾病）和多功能高分子造影剂的探索也逐渐兴起，赵雅静等［28］构建了一种具有超声和磁共振双模态显像的可相变的高分子造影剂，在温度作用下发生相变可增强双模态显像效果；并在体内外实验中采用近红外光诱导光热治疗，以增强肿瘤消融，也取得了一定的效果［29］。由于高分子材料微泡外壳较硬，在治疗方面，脂质微泡在较低的声学输出下即能引起微泡破裂，达到治疗效果，对超声具有更强的反应灵敏性，但脂质微泡在体内稳定性差、维持时间短、易受网状内皮系统吞噬。高分子材料微泡在体内粒径分布更集中，生物降解性良好，耐受性好，不仅克服了脂质微泡的不足，而且对组织具有更强的特异性和靶向性，将会尽可能在治疗中减少其对正常组织、血管和细胞的损害，使其更具有潜力应用于临床治疗。

5　问题与展望

高分子材料超声微泡在组织显像及载药载基因对疾病的诊断与治疗方面已经取得一定的成果，但其仍然存在一些亟需解决的问题：①高分子材料作为外壳，在低机械指数的超声造影下显影较差；②多聚体材料在体内可自然降解，但其降解过程较慢，易停留于血管影响局部血液循环；③超声辐照下对微泡的破坏、各项参数设置不当，也可能对邻近组织产生损伤；④以高分子材料为膜其成本较高，在生产使用中可存在一定的限制。尽管在疾病的诊断与治疗中，很多方面仍处于实验室阶段，但高分子材料超声微泡的稳定性、安全性、可塑性、有效性等特点所存在的潜力，将使其具有良好的临床应用前景。

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10.3969/j.issn.1005-5185.2016.07.022

R445.1

2015-12-01

2016-04-17

（本文编辑 张春辉）

三峡大学医学院 湖北宜昌 443002

赵 云 E-mail： zhaoyun@ctgu.edu.cn