斜卧青霉转录调控蛋白Hac1过表达菌株的构建

马小娟，韦小敏，来航线，房艳华，胡轶伦

(西北农林科技大学 a 资源环境学院，b 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)



斜卧青霉转录调控蛋白Hac1过表达菌株的构建

马小娟a，韦小敏a，来航线a，房艳华a，胡轶伦b

(西北农林科技大学 a 资源环境学院，b 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)

【目的】 以增强型绿色荧光蛋白为报告基因，构建斜卧青霉转录调控蛋白Hac1激活形式基因(Hac1i)随机插入过表达菌株和非激活形式基因(Hac1u)原位插入过表达菌株，并初步观察Hac1基因的2种不同编码蛋白在菌丝内部的运动情况，为进一步研究转录调控蛋白Hac1的功能奠定基础。【方法】 分别克隆ptrA筛选标记、gpdA启动子、Hac1i编码区、eGFP编码区及终止子，利用融合PCR融合克隆片段，构建Hac1i随机插入表达盒；再分别克隆Hac1上游臂及编码区、eGFP编码区及终止子、ptrA筛选标记、Hac1下游臂序列，融合克隆片段，构建Hac1u原位插入表达盒。将2种表达盒分别转化斜卧青霉原生质体，通过吡啶硫胺素筛选标记、PCR扩增等检测获得阳性转化子，荧光显微镜观察融合蛋白的表达及运动情况。【结果】 成功构建了Hac1i基因随机插入表达盒和Hac1u基因原位插入表达盒，利用原生质体转化将2种表达盒转入宿主斜卧青霉菌株，经PCR初步验证，得到了阳性转化子。阳性转化子在麸皮培养基上培养2～4 d后，可在菌丝内部清晰观察到强烈的绿色荧光信号，表明融合蛋白在菌丝体内得到了正确表达。【结论】 成功构建了Hac1i基因随机插入和Hac1u基因原位插入菌株。

斜卧青霉；荧光蛋白；转录调控蛋白Hac1

丝状真菌由于具有卓越的蛋白分泌能力，已被广泛应用于多种工业用酶，如纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、果胶酶等的生产中[1-2]。此外，由于具有接近高等真核生物的蛋白质分子折叠和修饰系统，丝状真菌在异源蛋白的活性重组表达方面也颇具吸引力[3]。由于工业生产的需要，人们常用基因工程方法(如强启动子控制、引入多拷贝、表达融合蛋白、缺失蛋白酶活力等)来提高丝状真菌异源蛋白的产量。然而，已有研究显示，丝状真菌在某些条件下的蛋白分泌通路仍然不够“通畅”，蛋白的分泌速率受到了制约，其表达的异源蛋白更是远远低于自身分泌蛋白的产量，这成为其工业应用中的一个主要限制因素[4-5]。

目前，研究者将研究重点集中在胞内蛋白质量控制的细胞机制、分泌途径改造、蛋白修饰加工以及工程菌稳定性等方面[6]，以期能充分挖掘丝状真菌作为宿主生产异源蛋白的巨大潜力。但过量表达的异源蛋白超出了细胞的承受能力，使多肽链不能及时正确折叠，导致内质网中的错误折叠或者未折叠蛋白累积，严重影响蛋白的转运和分泌，这是造成异源蛋白产量低的一个重要原因。当过量蛋白尤其是那些未折叠的蛋白和错误折叠的蛋白流经真核细胞内质网(Endoplasmic reticulum，ER)时，可以诱发所谓的蛋白分泌压力响应或ER压力响应的一系列调节反应，以实现对内质网压力的缓解。未折叠蛋白响应(Unfolded protein response，UPR)是这一响应中最为重要的一种调控机制[7]，UPR通过上调分子伴侣BIP1、二硫键异构酶PDI1等相关基因的表达量，使胞外蛋白的分泌量得到提高[8]。因此，诱导未折叠蛋白响应成为研究蛋白分泌调控机制的热点。

本研究通过克隆UPR途径中重要调控蛋白Hac1的激活形式蛋白编码基因(Hac1i)和非激活形式蛋白编码基因(Hac1u)，利用抗吡啶硫胺素的基因(ptrA)为筛选标记、eGFP为报告基因，分别构建了Hac1i基因随机插入表达盒和Hac1u基因原位插入表达盒，并成功将表达盒引入宿主体内,观察激活蛋白和非激活蛋白的表达情况，以期为进一步研究Hac1转录调控蛋白功能及丝状真菌蛋白分泌调控机制提供基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和质粒斜卧青霉114-2菌株、质粒pME2892 (含抗吡啶硫胺素的基因ptrA，用作选择标记)和质粒pIG1783(含有增强型绿色荧光蛋白基因eGFP)，均由山东大学提供；质粒pEASY-Hac1i(含Hac1的激活形式蛋白编码框)，由西北农林科技大学资源环境学院农科楼705实验室构建；大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α购自北京全式金公司。

1.1.2工具酶及试剂EasyTaqDNA聚合酶、高保真High Fidelity DNA聚合酶、FastPfuFly DNA聚合酶、DNA Marker 2k、2k Plus Marker、λHind Ⅲ DNA Marker，购自北京全式金公司；限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、Hind Ⅲ，购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒，购自BioTeKe公司；胶回收试剂盒，购自Omega公司；吡啶硫胺素、溶菌酶，购自Sigma公司。PCR引物合成由上海生工生物工程公司完成；培养基组分、试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.3培养基LB液体培养基：蛋白胨1 g/L，酵母粉0.5 g/L，NaCl 1 g/L，pH 7.0～7.4。

斜卧青霉菌菌丝生长固体培养基：20 g/L琼脂粉，麸皮0.1 g/mL，煮沸30 min后，4层纱布过滤，挤出麸皮汁，定容，加琼脂粉，加热融化，分装。

菌丝基础培养基Mandels’营养盐液：KH2PO43 g/L，NaNO32.6 g/L，尿素0.5 g/L，FeSO4·7H2O 7.5 mg/L，MnSO4·H2O 2.5 mg/L，ZnSO4·7H2O 3.6 mg/L，CoCl2·6H2O 3.7 mg/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.5 g/L，蛋白胨1 g/L，pH约5.5。

50×的Vegol’s盐溶液：Na3C6H5O7·2H2O 125 g/L，KH2PO4250 g/L，NH4NO3100 g/L，MgSO4·7H2O 10 g/L，CaCl2·2H2O (单独溶解后加入) 5 g/L，C6H8O7·H2O 0.05 g/mL，ZnSO4·7H2O 0.05 g/L，Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O 0.01 g/L，CuSO4·5H2O 2.5 g/L，MnSO4·H2O 0.5 g/L，H3BO3(无水) 0.5 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 g/L，生物素0.1 g/L。

吡啶硫胺素：1 mg吡啶硫胺素溶于20 mL水，细菌过滤器过滤，分装保存。

转化子筛选培养基：1×Vegol’s盐溶液，质量分数0.4 %吡啶硫胺素，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L。

再生培养基上层：1×Vegol’s盐溶液，葡萄糖20 g/L，山梨醇182 g/L，琼脂糖0.8 g/L，分装每瓶20 mL。

再生培养基下层：山梨醇182 g/L，琼脂糖0.8 g/L。

1.2方法

1.2.1斜卧青霉基因组DNA的提取及检测参照曲音波[9]的方法提取斜卧青霉基因组DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。

1.2.2PCR引物设计根据已知序列，运用Primer 5.0软件设计引物。PCR引物由上海生工生物工程公司合成，具体所用引物序列见表1。

表 1　本研究所用引物Table 1　Primers used in this study

1.2.3Hac1i基因随机插入表达盒的构建(1)ptrA筛选标记、gpdA启动子、Hac1i和eGFP编码区及终止子序列的扩增。在高保真FastPfuFly DNA聚合酶的作用下，以质粒pME2892为模板使用引物PtraF和PtraR扩增ptrA筛选标记，预期片段长度2 008 bp。使用引物PgpdA-F-PtraR(携带ptrA基因上的25个碱基作为重叠序列)和PgpdA-R-HacF(末端携带斜卧青霉基因组编码区的25个碱基作为重叠序列)从斜卧青霉基因组中扩增gpdA启动子，预期片段长度1 350 bp。使用引物Hac-AC-F和Hac-AC-R-gfp(末端携带质粒pIG1783中eGFP编码区的24个碱基作为重叠序列)从质粒pEASY-Hac1i扩增Hac1i编码区，预期片段长度为1 100 bp。以质粒pIG1783为模板，用引物gfpT-F和gfpT-R扩增eGFP编码区及终止子，预期片段长度为1 500 bp。对4个扩增片段进行8%琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收纯化目的片段。

(2)表达盒的构建。上述4个片段中，片段ptrA筛选标记末端和gpdA启动子连接处、gpdA启动子和Hac1i编码区连接处、Hac1i编码区和eGFP编码区及终止子连接处形成相同的粘性末端，片段末端互为引物，连城一条片段。将ptrA筛选标记、gpdA启动子、Hac1i编码区、eGFP编码区及终止子以物质的量比为1∶2∶2∶1的比例通过融合PCR[10]克隆片段，使用巢式引物Ptra-NF2和gfpT-NS1对融合片段进行克隆，构建Hac1激活形式基因随机插入表达盒(图1)，预期表达盒长度为 5 500 bp。用Primer 5.0软件分析限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、Hind Ⅲ在融合片段内的酶切位点，获得预期酶切片段长度；对融合片段分别进行相应的酶切，酶切产物进行8%琼脂糖凝胶电泳检测，验证融合的正确性。

1.2.4Hac1u原位插入表达盒的构建(1)Hac1上游臂及编码区、eGFP编码区及终止子、ptrA筛选标记和Hac1下游臂序列的扩增。在高保真FastPfuFly DNA聚合酶作用下，使用引物Hac1-NS1和Hac-NAC-R-gfp(末端携带eGFP编码区的24个碱基作为重叠序列)，从斜卧青霉基因组中克隆Hac1上游臂及编码区，预期片段长度为 3 907 bp。以质粒pIG1783为模板，使用引物gfpT-F和gfpT-R扩增eGFP编码区及终止子，预期片段长度为 1 500 bp。以质粒pME2892为模板，使用引物PtraF-gfpT(携带eGFP编码区后部的25个碱基作为重叠序列)和PtraR扩增ptrA筛选标记，预期片段长度为2 008 bp。使用引物Hac1-LD1(前端携带ptrA基因的24个碱基作为重叠序列)和Hac1-LD2，从斜卧青霉基因组中克隆Hac1下游臂序列，预期片段长度为2 182 bp。对4个扩增片段进行8%琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收纯化目的片段。

图 1　Hac1i基因随机插入表达盒的构建示意图Fig.1　Construction of expression cassette of random integration of Hac1i

(2)表达盒的构建。将Hac1上游臂和编码区、eGFP编码区和终止子、ptrA筛选标记、Hac1下游臂以物质的量比1∶2∶2∶1的比例通过PCR融合克隆片段，用巢式引物Hac1-NS1-1和Hac1-NS2对融合片段进行克隆，构建预期长度为9 000 bp的Hac1非激活形式基因原位插入表达盒(图2)。用Primer 5.0软件分析融合片段的酶切位点，采用限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、HindⅢ进行酶切反应，对酶切产物进行8%琼脂糖凝胶电泳检测，验证融合的正确性。

图 2　Hac1u基因原位插入表达盒的构建Fig.2　Construction of expression cassette of situ integration of Hac1u

1.2.5原生质体转化及转化子的鉴定参照韦小敏[11]的方法并稍加改动(玻璃纸改为称量纸，玻璃丝改为擦镜纸)，进行原生质体的制备和转化，将上述Hac1i基因随机插入表达盒和Hac1u原位插入表达盒转化到斜卧青霉原生质体中。将转化好的原生质体倒在含有质量分数0.4%吡啶硫胺素的再生平板上层，然后将培养基倒在下层培养基上，待凝固后，30 ℃避光培养3～5 d，待阳性转化子长出后进行传代培养，同时将阳性转化子接种于菌丝生长培养基，提取转化子DNA作为模板，以斜卧青霉菌株114-2 DNA为阴性对照模板，用引物PtrA-ZSF和PtrA-ZSR(表1)进行PCR检测，Hac1i基因随机插入表达盒是否已经整合入斜卧青霉基因组中，若是整合成功则会得到长度为1 526 bp的PtrA条带，而对照模板不会扩增出条带；Hac1u基因原位插入表达用PtrA-ZSF、PtrA-ZSR及PtrA-YZF、Hac1-LD2 2对引物(表1)分别检测，整合成功时会得到 1 526 bpPtrA条带和2 324 bp的连接PtrA和Hac1下游臂的条带。

1.2.6绿色荧光蛋白的检测选取经PCR检测较好的阳性转化子接种于菌丝生长培养基上，30 ℃、190 r/min培养2～3 d后挑取菌丝制成压片，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，用蓝紫外光激发，分别用40倍镜和100倍镜对菌丝进行观察。

2　结果与分析

2.1斜卧青霉基因组DNA的提取

用8%琼脂糖凝胶电泳检测斜卧青霉基因组DNA，得到与预期长度一致的约20 000 bp的片段，且条带均一，没有杂代或拖尾(图3)，表明所得DNA较纯，可用于后续试验。

2.2Hac1i基因随机插入表达盒的构建

2.2.1表达盒各部件的扩增以质粒pME2892为模板扩增得到ptrA筛选标记片段，长度为2 008 bp(图4泳道1)；以斜卧青霉基因组为模板扩增得到gpdA启动子片段，长度为1 350 bp(图4泳道2)；从质粒pEASY-Hac1i中扩增得到Hac1i编码区片段，长度为1 100 bp(图4泳道3)；以质粒pIG1783为模板扩增出eGFP编码区及终止子，长度为1 500 bp(图4泳道4)。

毛泽东思想是一个完整的科学体系，它具有多方面内容，在关于新民主主义革命、社会主义革命和建设、革命军队建设和军事战略、政策和策略、思想政治工作和文化工作及党的建设等方面，都以独创的理论丰富和发展了马克思列宁主义。毛泽东思想作为中国化的马克思列宁主义，一方面，它是与马克思列宁主义一脉相承的科学体系，其基本理论原则无不根源于马克思列宁主义；另一方面，毛泽东思想中的许多理论原则和经验总结，又都是同中国革命和建设的实际紧密结合在一起的，是以往的马克思列宁主义经典作家从未论述过的，或仅仅是提出了问题而未来得及解决的，凝结着中华民族的优秀思想和中国共产党人的实践经验。

图 3斜卧青霉基因组DNA的质量检测

M.λHind Ⅲ DNA Marker；1.斜卧青霉基因组

Fig.3Detection ofPenicilliumdecumbensDNA

M.λHind Ⅲ DNA Marker;1.Penicilliumdecumbensgenome

2.2.2表达盒的组装采用融合PCR方法将ptrA筛选标记、gpdA启动子、Hac1i编码区以及eGFP编码区和终止子片段进行融合，获得Hac1i基因随机插入表达盒，采用巢式PCR对该融合片段进行扩增，获得了长度约为5 500 bp的片段(图5泳道1)，与预期结果一致。用限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、Hind Ⅲ分别对巢式PCR得到的DNA片段进行酶切，结果Hind Ⅲ酶切得2 524和3 283 bp的2条条带(图5泳道2、3)，XhoⅠ酶切得2 182和 3 625 bp的2条条带(图5泳道4、5)，EcoRⅠ酶切后只有1条4 900 bp的条带(图5泳道6、7),与预期结果一致，说明片段融合正确。

图 4　Hac1i基因随机插入表达盒4个片段的PCR扩增M.2k Plus Marker；1.ptrA筛选标记；2.gpdA启动子； 3.Hac1i编码区； 4.eGFP编码区及终止子Fig.4　PCR amplification 4 fragments of activation gene of Hac1 random expression boxM.2k Plus Marker;1.Expression cassette of ptrA gene; 2.Promoter of gpdA;3.The protein-coding region of active Hac1; 4.The protein-coding region of eGFP and terminator图 5　Hac1i基因随机表达盒的巢式PCR扩增和 限制性酶切验证M.2k Plus Marker;1.Hac1i基因随机插入表达盒的巢式扩增 产物；2～3.HindⅢ酶切；4～5.XhoⅠ酶切；6～7.EcoRⅠ酶切Fig.5　Amplification of Hac1i random expression cassette using nest PCR and restricted enzyme cutting to examineM.2k Plus Marker;1.PCR products of random expression cassette；2-3.Digested by Hind Ⅲ；4-5.Digested by XhoⅠ； 6-7.Digested by EcoRⅠ

2.3Hac1u基因原位插入表达盒的构建

2.3.1表达盒各部件的扩增以斜卧青霉基因组为模板扩增得到表达盒的Hac1上游臂及编码区片段，长度为3 907 bp(图6泳道2)；以质粒pIG1783为模板扩增出eGFP编码区及终止子，长度为1 500 bp(图6泳道1)；以质粒pME2892为模板扩增出ptrA筛选标记片段，长度为2 008 bp(图6泳道3)；以斜卧青霉基因组为模板扩增得到Hac1下游臂片段，长度为2 182 bp(图6泳道4)。

2.3.2表达盒的组装用融合PCR方法将Hac1上游臂及编码区、eGFP编码区及终止子、ptrA筛选标记和Hac1下游臂4段序列融合，获得Hac1u基因原位插入表达盒，用巢式PCR方法对该表达盒进行扩增，获得了长度约为9 000 bp的片段(图7泳道1)。采用限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、Hind Ⅲ分别对巢式PCR得到的DNA片段进行酶切，其中XhoⅠ酶切得2 133和6 600 bp的2条片段(图7泳道2)，EcoRⅠ酶切得667，1 153，1 900，5 632 bp的4条片段(图7泳道3)，Hind Ⅲ酶切没有获得相应的酶切片段，与预期结果一致，说明片段融合正确。

图 6　Hac1u基因原位插入表达盒4个片段的PCR扩增M.2k Plus Marker;1.eGFP编码区及终止子; 2.Hac1上游臂及编码区;3.ptrA筛选标记;4.Hac1下游臂Fig.6　PCR amplification 4 fragments of non-activation gene of Hac1 in situ expression cassetteM.2k Plus Marker;1.The protein-coding region of eGFP and terminator;2.Up-stream sequence and conding region ofHac1;3.ptrA genome;4.Down-stream sequence of Hac1图 7　Hac1u基因原位插入表达盒的巢式 PCR和限制性酶切验证M.λHind Ⅲ DNA Marker;1.Hac1u基因原位插入表达 盒巢式PCR扩增产物；2.EcoRⅠ酶切；3.XhoⅠ酶切；4.Hind Ⅲ酶切Fig.7　Amplification of situ expression cassette using nest PCR and identificationusingrestricted enzyme cuttingM.λHind Ⅲ DNA Marker;1.PCR products of situ expression cassette; 2.Digested by EcoRⅠ；3.Digested by XhoⅠ；4.Digested by Hind Ⅲ

2.4阳性转化子的PCR鉴定

由图8可知，Hac1i基因过表达菌株扩增出 1 526 bp的ptrA基因条带，阴性对照无扩增条带产生，表明Hac1i基因随机插入表达盒已经成功整合入转化菌株基因组中。

图 8　Hac1i基因和Hac1u基因表达盒的阳性转化子鉴定结果M.2k DNA Marker;1,5，7.阴性对照;2.Hac1i随机插入表达盒ptrA基因； 3～4.Hac1u原位插入表达盒ptrA基因；6.连接ptrA和Hac1下游臂的片段Fig.8　Identification of positive trans-formants of activation and non-activation genes of Hac1M.2k DNA Marker;1,5,7.Negative control;2.Hac1iptrA genom;3-4.Hac1u ptrA genom; 6.The fragment connecting ptrA and Hac1 downstream arm

2.5构建菌株的绿色荧光观察

40倍镜观察结果显示，Hac1i基因过表达菌株(图9-A1)和Hac1u基因过表达菌株(图9-B1)菌丝体内部均产生了强烈的荧光信号，说明融合蛋白在菌丝体内得到了正确表达;菌丝体外部未检测到荧光信号。当显微镜放大到100倍时，可以清晰观察到荧光信号呈点状分布，在菌丝边缘及顶端未发现绿色荧光颗粒(图9-A2、B2)，说明Hac1i和Hac1u均在菌丝内部有分布。

图 9　Hac1i基因和Hac1u基因表达盒阳性转化子的绿色荧光观察 A1,A2.分别为Hac1i随机插入菌株40倍镜和100倍镜下菌丝荧光观察； B1,B2.分别为Hac1u原位插入菌株40倍镜和100倍镜下菌丝荧光观察Fig.9　Observation of green fluorescence of positive trans-formants of activation and non-activation genes of Hac1 A1,A2.Observation of green fluorescenceof Hac1i under 40 times and 100 times microscope; B1,B2.Observation of green fluorescenceof Hac1u under 40 times and 100 times microscope

3　讨　论

丝状真菌卓越的蛋白分泌能力确立了其在工业用酶生产中的核心地位，一些菌株已成为优良的工业生产菌株。许多同源和异源真菌蛋白在丝状真菌中已实现了高效表达，但是来源于其他高等生物的基因的表达受到瓶颈限制，产量不高[12]。因此一些基因工程手段被应用到菌株改造中，以期充分挖掘丝状真菌作为细胞工厂生产异源蛋白的巨大潜力。

近年来，丝状真菌蛋白合成分泌调控机制研究取得很大进展，UPR机制是研究较多的蛋白分泌调控机制之一，UPR的作用是当过量未折叠蛋白和错误折叠蛋白流经真核细胞内质网时，其可以上调分子伴侣BIP1、二硫键异构酶PDI1等相关基因表达量，促进蛋白质的折叠和运输，减轻细胞压力[13-14]。Hac1是UPR途径中的重要转录调控蛋白，当细胞中发生UPR时，激活的Hac1进入细胞核后与UPR靶标基因启动子区的未折叠蛋白响应元件区域(unfolded protein response element，UPRE)结合，造成UPR途径相关的折叠酶、分子伴侣、糖基化修饰酶和蛋白易位及膜泡运输等相关蛋白编码基因表达量上调[15]。虽然Hac1及其激活机制在酵母、丝状真菌里氏木霉和构巢曲霉上的研究较为深入，但Hac1转录调控蛋白的功能仍未得到全面解析。

在已有研究基础上，本研究构建了斜卧青霉114-2菌株转录调控蛋白Hac1的激活形式蛋白编码框和非激活形式蛋白编码框，并分别以gpdA基因启动子和Hac1基因启动子为指引，以绿色荧光蛋白基因为报告基因，成功构建了Hac1基因的过表达菌株。Hac1激活形式蛋白过表达菌株以gpdA组成型启动子为指引，Hac1的激活形式基因随机插入转化子基因组中，其表达不受培养条件影响，能在无药物或异源蛋白表达的条件下诱导细胞UPR响应，可用于分析Hac1蛋白对细胞产生的影响，以及Hac1可能对下游基因表达产生的影响；以绿色荧光蛋白为报告基因，激活的Hac1携带绿色荧光信号，使动态观察Hac1在胞内运动行为成为可能。Hac1非激活形式蛋白过表达菌株以自身基因启动子为指引，以绿色荧光蛋白为报告基因，原位替换了原有基因，使在原始条件下观察非激活Hac1在胞内的运动行为成为可能。对激活与非激活Hac1在胞内的运动行为进行对比分析，将有助于对Hac1功能进行全面解析。本试验构建的2株不同表达形式的转录调控蛋白Hac1过表达菌株为研究Hac1转录调控蛋白的功能提供了研究材料，也为进一步探讨丝状真菌蛋白分泌调控机制奠定了基础。

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Construction of over expression strain of green fluorescent protein labeled transcription regulation proteinHac1

MA Xiaojuana，WEI Xiaomina，LAI Hangxiana，FANG Yanhuaa，HU Yilunb

(aCollegeofNaturalResourcesandEnvironment，bCollegeofLifeSciences，NorthwestA&FUniversity，Yangling，Shaanxi712100，China)

【Objective】 This paper constructedover expression strain by randomly inserting activated transcription regulation protein geneHac1(Hac1i) and stain in-situ inserted by non-activated transcription regulation protein geneHac1(Hac1u) ofPenicilliumdecumbenswith enhanced green fluore scent protein as a reporter gene.The motion of these two encoded proteins in the strains was also observed.This paper would provide basis for further investigating the function of transcription regulation proteinHac1.【Method】 The random integration expression cassette ofHac1iwas constructed by cloning selection marker,gpd Apromoter,Hac1iprotein-coding region,eGFP protein-coding region and terminatorand fusing these fragmentsusing PCR fusion.The in-situ integration expression cassette ofHac1uwas constructed by cloningup-stream sequence and coding region ofHac1,protein-coding region ofeGFPand terminator,selection marker and down-stream sequence ofHac1,and fusing these fragments.Then these two expression cassettes were put intoPenicilliumdecumbensprotoplasts,positive trans-formants were detected by thiamine pyridine resistance and PCR amplification,andeGFPwas observed under microscope.【Result】 The random integration ofHac1iand situ integration ofHac1uwere success fully cloned by fusion PCR,and they were inserted into hostPenicilliumdecumbensstrainusing protoplast transformation.PCR verification indicated that positive trans-formants were success fully obtained.Green fluorescence distribution emerged on hyphae carryingthe expression cassettesHac1iandHac1uafter 2 to 4 days culture on bran medium.【Conclusion】 Strainswithrandom integrationHac1iand situ integrationHac1uwere constructed successfully.

Penicilliumdecumbens;fluorescent protein;transcription regulation proteinHac1

网络出版时间:2016-07-1208:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.08.030

2015-01-30

国家自然科学基金项目(31200058)

马小娟(1989-)，女，山西吕梁人，在读硕士，主要从事微生物资源与利用研究。E-mail：daidaich@foxmail.com

来航线(1964-)，男，陕西礼泉人，副教授，博士，主要从事微生物生态和微生物资源与利用研究。

E-mail：laihangxian@163.com

Q93

A

1671-9387(2016)08-0205-08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160712.0845.060.html