肺炎支原体RNA检测在儿童肺炎支原体肺炎疗效监测中的应用价值

郭　丽　孙　琳　郭　琰　李勤静　吴喜蓉　刘　芳　李颖佳　王杏云　王　婷

徐保平1　冯雪莉1　申阿东1



·论著·

肺炎支原体RNA检测在儿童肺炎支原体肺炎疗效监测中的应用价值

郭丽1,2孙琳1郭琰1李勤静1吴喜蓉1刘芳1李颖佳1王杏云1王婷1

徐保平1冯雪莉1申阿东1

目的探讨应用肺炎支原体RNA检测(RNA实时荧光恒温扩增技术,MP-SAT)作为儿童肺炎支原体肺炎(MPP)治疗效果监测指标的可行性和应用价值。方法 纳入北京市平谷区妇幼保健院住院的社区获得性肺炎患儿，其中符合MPP诊断标准者为MPP组，余为非MPP组。①以血清肺炎支原体(MP)抗体(MP-Ab)检测为诊断MP感染的参照试验，考察MP-SAT诊断MP感染的敏感度和特异度。②对MP-SAT和血清MP-Ab均阳性MPP病例行动态观察，比较MP-SAT和血清MP-Ab在大环内酯类药物标准治疗不同时间的阳性率， MP-SAT转阴时间和临床痊愈时间。③比较不同MP-SAT转阴时间MPP病例发热时间、入院24 h内血常规(WBC、N、L)，超敏C反应蛋白(hs-CRP)和血清乳酸脱氢酶(LDH)及胸部X线指标的差异。结果MPP组73例，非MPP组150 例。MP-SAT诊断MP感染的敏感度和特异度分别为83.6%(61/73)、97.3%(146/150)。MPP组MP-SAT和血清MP-Ab均阳性61例，随治疗时间的延长，MP-SAT阳性率显著降低(P<0.05)，而血清MP-Ab的阳性率呈增高趋势(P<0.05)。61例临床痊愈时间平均为(3.0±0.9)周，MP-SAT转阴时间为(3.3±0.8)周，差异无统计学意义(P>0.05)。 MP-SAT转阴时间越长的病例表现为发热持续时间越长，入院24 h内中性粒细胞百分比、CRP、LDH水平越高，X线胸片大片实变比例越高，淋巴细胞百分比越低 (P<0. 05)。结论MP-SAT可作为评价MPP 转归以及判断大环内酯类药物疗效的指标。

肺炎支原体；社区获得性肺炎；RNA检测；诊断；临床疗效；儿童

肺炎支原体(MP) 引起的肺炎支原体肺炎(MPP)占住院儿童社区获得性肺炎(CAP)的10%～40%[1,2]。既往认为MP感染病情一般较轻，对大环内酯类抗生素效果好，或呈自限性。但近年来发现MP 感染所致的大叶性肺炎逐渐增多，且病情较重，部分病例治疗棘手[3,4]。目前，血清MP抗体(MP-Ab)检测是临床最常用的诊断MP感染方法，但MP感染后数月抗体仍能持续存在，无法准确反映药物的疗效和预后。

作为肺炎支原体RNA检测技术之一，RNA实时荧光恒温扩增技术(SAT)直接以病原体特异性RNA为扩增靶标，具无创性、操作简单和快速等特点。SAT属于活菌检测技术，在死亡的病原体中几乎检测不到RNA。目前已成功应用于结核分枝杆菌、沙门菌属、 肠道轮状病毒和泌尿生殖道沙眼衣原体等病原的检测[5～8]，然而SAT应用于儿童MPP检测尚未见报道。

1　方法

1.1研究设计以MP-Ab检测作为MPP诊断的参照试验，考察MP-SAT的诊断准确性；采集两者均阳性的病例于入院后24 h内，治疗后1、2、3、4和5周MP-SAT检测数据，分析MP-SAT转阴时间与临床表现的相关性。

1.2诊断标准CAP诊断依据《实用儿科学》第7版[9]和“儿童社区获得性肺炎管理指南(2013年修订版)”[10]，本文MPP的诊断标准满足以下任意1项：①入院24 h内MP-Ab≥1∶160；②大环内酯类抗生素标准治疗方案治疗4周内每周行MP-Ab检测，双份血清≥4倍升高。

1.3临床痊愈标准发热、咳嗽等临床症状消失，胸部X 线好转、渗出基本吸收，血常规及CRP检查结果恢复正常。

1.4纳入和排除标准①北京市平谷区妇幼保健院(我院)住院的符合CAP诊断患儿；②排除患有肺结核、免疫功能低下、院外已经应用大环内酯类抗生素治疗和首次MP-SAT阳性但未行复测的患儿。

1.5MP-Ab滴度测定血清标本以颗粒凝集法检测MP抗体。按照SERODIA-MycoⅡ试剂盒使用说明书(日本富士瑞必欧株式会社)操作。

1.6MP-SAT检测方法医用棉签取咽部分泌物，将拭子头置于1 mL生理盐水浸泡贴管壁挤干，取500 μL加入到500 μL裂解液中备用。送至首都医科大学附属北京儿童医院儿研所检测。

采用MP核酸检测试剂盒(购自上海仁度生物科技有限公司)，待测样本加400 μL裂解液，阴性、阳性对照与待测样本同步进行，加入洗涤液洗涤2次，每管加入40 μL扩增反应液，震荡混匀，取30 μL磁珠悬液至微量反应管中，60℃温浴10 min，42℃温浴5 min，每孔加入10 μL SAT酶，放入核酸扩增仪检测。反应程序：荧光通道设定为FAM，每个循环为42℃ 1 min，共40个循环；每分钟采集荧光信号1次，共检测40次；从40℃～80℃行溶解曲线分析。样本曲线与阈值曲线交叉点的横坐标读数(监测时间)为dt，dt≤35 min为阳性，dt>40 min为阴性；在35～40 min的样本重新检测，dt≤35 min为阳性，dt>35 min为阴性。

1.7MPP治疗方案我院MPP常规治疗为予阿奇霉素10 mg·kg-1·d-1，每日1次，首个疗程静脉滴注5 d，第2、3或4个疗程根据病情静脉滴注或口服3 d，间隔时间为3 d。

1.8观察指标①基于入院24 h内第1次MP-SAT检测的诊断参数；②MP-SAT转阴时间和临床痊愈时间；③MP-SAT 5周内(每周1次)持续阳性病例的发热时间，入院24 h内血常规(WBC、N、L)，超敏C反应蛋白(hs-CRP)，血清乳酸脱氢酶(LDH)及胸部X线指标。

1.9统计学方法采用SPSS 19.0 软件对数据行统计学分析。计数资料采用百分比表示，阳性率比较采用χ2检验或Fisher 确切概率法。非正态分布资料以中位数(P25～P75)表示，组间比较采用Kruskal-WallisH检验。计算MP-SAT诊断MPP的敏感度、特异度、阴性预测值和阳性预测值及其95%CI。P<0.05 为差异有统计学意义。临床痊愈时间和MP-SAT转阴时间采用GraphPad Prism 5软件制作生存曲线。

2　结果

2.1一般情况2014 年12 月至2015 年9月我院收治CAP患儿264例，其中233例符合纳入标准进入分析(图1)，MPP 73例，年龄(4.9±2.7)岁 ，男33例；非MPP 150 例，年龄(4.3±2.0)岁， 男73例。 两组年龄、性别构成差异无统计学意义(P>0.05)。

图1研究对象筛选流程

2.2MP-SAT诊断MPP的参数以MP-Ab为参照试验，MP-SAT诊断MP感染的真阳性值、真阴性值、假阳性值、假阴性值分别为61、146、12和4例；敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及其95%CI分别为83.6%(73.1%～91.2%)、97.3%(93.3%～99.3%)、93.8%(84.9%～96.3%)和92.4%(87.1%～96.1%)。

2.3MP-SAT和MP-Ab在不同观察时点MP检出率MP-SAT和血清MP-Ab同时阳性61例。表1显示，MP-SAT检出率随大环内酯类抗生素治疗时间的延长显著降低(P<0.05)，4周时点阳性率仅6.6%；MP-Ab阳性率呈增高趋势，至3周和4周，阳性率升至100%；2周时点MP-SAT和MP-Ab检出率差异无统计学意义，余时点的差异均有统计学意义。

2.4MP-SAT转阴时间与临床痊愈时间的相关性图2显示，61例MP-SAT和血清MP-Ab均阳性病例的临床痊愈时间为(3.0±0.9)周，MP-SAT转阴时间为(3.3±0.8)周，差异无统计学意义(t=1.78，P>0.05)。

表1MP-SAT阳性肺炎支原体肺炎病例不同时点MP-Ab和MP-SAT检出率[n(%)]

治疗时间MP-SAT(n=61)MP-Ab(n=61)χ2P<24h61(100)34(55.7)34.67<0.011周60(98.4)40(65.6)22.18<0.012周52(85.5)59(96.7)4.890.0543周24(39.3)61(100)53.11<0.014周4(6.6)61(100)106.99<0.015周0未测--χ2185.0780.62P0.010.01

图2MP-SAT转阴时间与临床痊愈时间比较

2.5MP-SAT转阴时间与MPP严重程度的相关性表2显示，MP-SAT转阴时间越长的病例表现为发热持续时间越长，入院24 h内中性粒细胞百分比、CRP、LDH水平越高，X线胸片肺大片实变比例越高，淋巴细胞百分比越低，5个时点间差异有统计学意义(P<0. 05)。

表2MP-SAT不同转阴时间肺炎支原体肺炎患儿的临床症状、影像学及实验室指标比较[n(%)，M(P25,P75)]

指标MP-SAT转阴时间1周(n=1)2周(n=8)3周(n=28)4周(n=20)5周(n=4)χ2P发热天数/d12(0,3)3.5(3,4)6(5,6)6.5(5.3,7)42.81<0.01X线胸片大片肺实变0(0)0(0)2(7.1)5(25)4(100)16.96<0.01外周血WBC/×109·L-16.77.5(6.0,10.6)9.5(7.4,10.8)9.1(7.8,11.7)8.1(6.2,9.7)3.25>0.05淋巴细胞0.360.36(0.28,0.42)0.30(0.27,0.36)0.29(0.23,0.33)0.15(0.084,0.26)10.68<0.05中性粒细胞0.530.55(0.52,0.61)0.59(0.53,0.66)0.66(0.58,0.71)0.83(0.64,0.89)12.97<0.05CRP/mg·L-129.5(8.3,13.8)12(5.3,17.0)15.5(10,24.8)28.5(11.3,48.0)10.80<0.05乳酸脱氢酶/U·L-1156213(146,250)232(201,299)243(183,291)302(271,384)9.86<0.05

3　讨论

MPP具临床表现多样，病程长和反复等特点，易发生肺外并发症，故探索一种直接、快速、操作简便方法，实时监测儿童MPP治疗效果，有较重要的临床意义。MP-SAT作为建立在RNA恒温扩增技术和实时荧光检测技术基础上的新一代核酸检测技术，其优点在于以MP RNA为靶标进行恒温扩增检测。由于RNA仅在活菌中存在，MP死亡后RNA快速降解，因此该方法的阳性可提示MP的近期感染，而不是既往感染。本研究以MP-Ab为诊断MP感染的参考标准，显示MP-SAT的敏感度和特异度分别为83.6%和97.3%，提示其具有较好的诊断价值，且特异度非常高，阴性可排除MP感染。同时随着治疗病情好转，体内MP被杀灭后RNA快速降解，可用于MPP的预后判断。本研究结果显示， 3～4周规范大环内酯类药物治疗过程中，MP-SAT阳性率随入院治疗时间的延长显著降低，治疗3周时点其阳性率明显下降(39.3%)，4周时点MP-SAT阳性率为6.6%；而传统的血清MP-Ab检测由于在MP感染的早期存在窗口期，随治疗疗程延长其滴度反而持续升高，在入院后<24 h和1周内的阳性率较低(约60%)，在2周及之后时点其阳性率显著升高(>95%)。

儿科应用大环内酯类抗生素的疗程2 ～3周, 但因考虑停药过早易复发, 总疗程常达3～4周。目前，大环内酯类抗生素停药主要依据临床症状消失、肺部炎症基本消失及炎性指标恢复正常[11]，仍缺乏客观的停药指征。本研究结果显示，MP-SAT转阴时间与临床痊愈时间更为接近，两者差异无统计学意义，提示MP-SAT 动态变化可为临床动态观察大环内酯类抗生素治疗效果提供依据。MP-SAT转阴时间长可能与体内MP不易清除和存在较强的免疫炎症反应有关[12]，为此本研究还探讨MPP患儿MP-SAT检测结果与临床症状、实验室指标和X线胸片的相关性。结果显示，发热持续时间，入院24 h内中性粒细胞百分比、CRP、X线胸片大片肺实变与MP-SAT转阴时间成正相关，均提示转阴时间越长，患儿入院时的炎症反应越严重；此外，MP-SAT转阴时间越长，淋巴细胞百分比越低，可能与MP感染后免疫抑制有关[13]，淋巴细胞数量减低者可能对MP更为易感，发病后更易进展为肺炎[14,15]。同时LDH水平亦与MP-SAT转阴时间呈正相关，考虑可能病情严重导致的全身组织器官炎症损害严重，重症感染致使机体处于高碳酸血症和缺氧状态，缺氧时细胞膜通透性增加，使LDH从细胞内释放至血液中[16]。提示对这部分病例临床延长大环内酯类抗生素疗程及应用免疫调节治疗可能会减轻相关临床症状和减少后遗症的发生。

综上，MP-SAT与MPP的疾病严重程度相关性较好，可作为评价MPP转归以及判断大环内酯类药物疗效的指标。

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(本文编辑：丁俊杰)

SHEN A-dong，E-mail:shenad16@hotmail.com; FENG Xue-li，E-mail:13901212405@sina.com

Objective To evaluate the clinical utility ofMycoplasmapneumoniaRNA detection (real-time isothermal transcription-mediated RNA amplification assay, MP-SAT) in the treatment ofMycoplasmapneumoniaepneumonia in children.MethodsChildren with community-acquired pneumonia in Beijing Pinggu District Maternal and Child Health Care Hospital, according to theMycoplasmapneumoniaediagnostic criteria，were divided into theMycoplasmapneumoniaepneumonia and non-Mycoplasmapneumoniaepneumonia groups. ①When the results of serological tests were considered as the standard，the sensitivity and specificity of MP-SAT were evaluated. ②MP - SAT and serum MP -Ab positive cases were observed dynamically，the detection rate of MP-SAT and MP-Ab in different treatment course and the times of MP-SAT turning to negative and clinical recovery were compared. ③The differences of fever duration after macrolide administration，blood routine inspection (WBC, N, L), hypersensitive c-reactive protein (hs-CRP), serum lactate dehydrogenase (LDH) and the imaging results admitted to hospital within 24 hours were compared.ResultsMycoplasmapneumoniaepneumonia group included 73 cases, non-Mycoplasmapneumoniaepneumonia group included 150 cases. The sensitivity, specificity of MP-SAT were 83.6%(61/73) and 97.3%(146/150),respectively. Children with both MP-SAT and MP-Ab positive results were followed to evaluate the treatment effect. After the treatment, the detection rate of SAT reduced significantly (P<0.05), while detection rate of serum MP-Ab increased significantly (P<0.05). The time of clinical recovery was (3.0±0.9) weeks, similar to that of MP-SAT turning to negative(3.3±0.8) weeks (P>0.05). Those with longer time of turning to negative had a longer fever duration after macrolide administration，increasing neutrophil，decreasing lymphocyte， higher level CRP and LDH, and large field of consolidation were more frequently observed on X-ray film (P<0.05).ConclusionMP-SAT can be used as an index for evaluation of the treatment outcome of MPP.

Mycoplasmapneumoniae；Community-acquired pneumonia；RNA detection;Diagnosis;Clinical effect;Children

10.3969/j.issn.1673-5501.2016.02.005

国家科技支撑计划: 2013BAI09B11; 首都卫生发展科研专项:2014-1-2094,2016-1-2092

1 首都医科大学附属北京儿童医院，北京市儿科研究所，儿科学国家重点学科，教育部儿科重大疾病研究重点实验室，儿童呼吸道感染性疾病研究北京市重点实验室北京，100045；2 北京市平谷区妇幼保健院北京，101200

申阿东，E-mail:shenad16@hotmail.com; 冯雪莉，E-mail:13901212405@sina.com

Clinical value of Mycoplasma pneumoniae RNA detection in the monitoring of Mycoplasma pneumoniae pneumonia treatment in children

GUOLi1,2,SUNLin1,GUOYan1,LIQin-jing1,WUXi-rong1,LIUFang1,LIYing-jia1,WANGXing-yun1,WANGTing1,XUBao-ping1,FENGXue-li1,SHENA-dong1(1DepartmentofRespiratory,BeijingChildren′sHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingKeyLaboratoryofPediatricRespiratoryInfectionDiseases;KeyLaboratoryofMajorDiseasesinChildrenandNationalKeyDisciplineofPediatrics(CapitalMedicalUniversity),MinistryofEducation;NationalClinicalResearchCenterforRespiratoryDiseases;RespiratoryInfectionDiseasesLab,BeijingPediatricResearchInstitute,BeijingChildren′sHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing, 100045; 2MaternalandChildHealthCareCenterofPingguDistrict;Beijing101200,China)

2016-02-18

2016-03-23)