SCN9A基因rs10930210位点多态性与癫痫发生的相关性

左松林，　李欣宇，　伍明刚，　张　昭，　王景涛，　朱金玲



SCN9A基因rs10930210位点多态性与癫痫发生的相关性

左松林1，李欣宇1，伍明刚1，张昭1，王景涛2，朱金玲3

目的探讨SCN9A基因多态性与癫痫发生的相关性。 方法搜集134例癫痫患者及正常对照组73例血样，提取全基因组DNA。聚合酶链反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)、测序法检测rs10930210位点多态性，比较该位点基因型和等位基因频率的差异。结果SCN9A基因rs10930210位点多态性在癫痫组与对照组间无显著差异(P>0.05)。结论SCN9A基因rs10930210位点多态性与癫痫易感性无关。

癫痫；SCN9A；单核苷酸多态性；遗传易感性

癫痫是一种以身体痉挛为特征的慢性神经系统疾病，由于神经皮质细胞的异常放电而导致的阵发性行为。近年来对癫痫家系进行的一系列相关研究已经证实，癫痫具有家族遗传性。另外，大量与癫痫相关的统计学研究表明，60%的癫痫患者在儿童期发病。目前，众多研究表明癫痫与电压门控钠离子通道(voltage -gated sodium channels，VGSCs)的功能改变有密切联系[1]。哺乳类动物脑细胞的VGSCs由一个α亚单位与一个或更多的辅助β亚单位组成的复合体所构成。负责编码人的电压门控性钠离子通道α亚单位的基因是SCN1A-SCN11A。现有的研究已表明，基因突变很容易导致离子通道结构的改变，导致通道功能异常，从而使动作电位的产生和传导发生紊乱、大脑神经元异常放电而导致癫痫的发生。

近年来，钠离子通道编码基因某些位点的单核苷酸基因多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，是否与癫痫的发病及临床疗效相关，引起人们的关注，为此我们选择SCN9A基因的TapSNPs研究其与癫痫发生的相关性，为癫痫的诊断、治疗与预防提供理论基础。

1　研究对象

研究对象为癫痫患者134例，正常对照组73例。患者均由佳木斯市中心医院鉴定。收集对照组和患者晨起静脉血3.0 ml。正常对照组的年龄和居住区域和患者组相匹配。

2　研究方法

2.1SNP位点的选择NCBI Gene数据库检索SCN9A基因，得到该基因的染色体位置为Chromosome 2,NC_000002.12 (166195185..166375987, complement)。进入HapMap网站，选择中文模式，HapMap 数据下选择通用基因组浏览器，标志或区域填写Chr2:166,195,185..166,375,987，数据来源，保存、查询及其它选择SNP genotype data，配置CHB，下载并保存dumped_region.hmp。运行Haploview，自动选择TagSNPs。根据有无合适酶切位点，选择本课题TagSNPs。最终选取SCN9A的TagSNP为rs10930210。

2.2SNP位点的引物设计在dbSNP数据库中查得rs10930210SNP位点的序列，用Primer5.0软件设计引物，对其用Oligo6.0软件进行检验，正向引物序列为F:ACAGGGATGATACAGGCACAC；反向引物序列为R:GCCAATCATTCCTCAACCAGC。扩增片段长度为469 bp，引物由上海生工合成。

2.3基因组DNA提取用基因组DNA提取试剂盒提取DNA (BioTeKe全血基因组提取试剂盒)，DNA置于-20℃冰箱保存备用。

2.4PCR扩增PCR反应体系为15 μl，包括2×Power Taq PCR Master Mix 8 μl，正反向引物各1 μl，模板DNA 1 μl，加ddH2O至15 μl。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，然后进行30个循环(94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s)，72 ℃终末延伸5 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小及特异性。

2.5限制性酶切酶切PCR产物。Rs10930210位点的内切酶为SspI。酶切反应体系为：PCR产物5 μl，10×buffer 1 μl，SspI酶为0.5 μl，最后加8.5 μl的ddH20，总体积为15 μl。酶切反应体系配好振荡混匀后，放置于37 ℃水浴箱中酶切5 min。65 ℃，8 min，终止酶切。

2.6琼脂糖凝胶电泳及分型15 μl酶切产物电泳分型：2%琼脂糖，电压150 V，电泳30 min，紫外线凝胶成像分析系统拍照并进行基因分型。

2.7DNA测序选取该位点3种不同基因型个体的PCR产物，送上海生工生物工程股份有限公司完成测序。

2.8统计学分析分别计算基因型频率和基因频率并进行卡方检验，P>0.05验证该群体为平衡群体。运用Microsoft Excel 2013统计癫痫组与对照组基因型频率和基因频率，实验组与对照组的比较采用两独立样本t检验，以P<0.05为具有统计学意义。

3　结　果

3.1Hardy-Weinberg遗传平衡检验(见表1)。

3.2SNP位点测序图及凝胶电泳图。

3.2.1rs10930210位点基因分型相应测序结果(见图1)。

3.2.2rs10930210位点基因分型相应凝胶电泳图(见图2)。

3.3癫痫组与对照组的SNP位点基因型及等位基因频率分布情况(见表2)。癫痫组与对照组的rs10930210位点的基因型和等位基因频率分布不存在显著差异。SCN9A基因位点rs10930210在癫痫病例组和对照组间基因型频率采用两独立样本t检验，结果P>0.05，两者之间不存在统计学意义；病例组和对照组之间的等位基因频率采用两独立样本t检验，结果P>0.05，两者之间无统计学差异。

表1　病例组与对照组等位基因的Hardy-Weinberg遗传平衡检验

注：自由度λ=2，癫痫组和对照组的观察数与预期数之间比较P>0.05

表2　癫痫组与对照组的rs10930210位点的基因型及等位基因频率分布比较

注：癫痫组的基因型频率与基因频率与对照组之间比较P>0.05，无统计学差异

图1a为野生型纯合子AA；b为突变杂合子AT；c为突变纯合子TT

图2M为DNA Marker，1为原样本(不做酶切的PCR产物)；2为突变纯合子TT(酶切产物)；3、4为野生型纯合子AA(酶切产物)；5、6为突变杂合子AT(酶切产物)

4　讨　论

癫痫是一类常见的中枢神经系统疾患，是由于大脑神经元异常同步放电引起的大脑功能障碍，其具有发作性、突然性、短暂性以及重复性等特征[2]。癫痫发生的病理生理学基础是大脑神经元细胞膜电生理兴奋性增高，易于形成癫痫性放电。遗传因素在癫痫发生机制中起到了很重要的作用。据唐章龙[2]等学者的资料显示，他们按照 Falconer 方法，对89个癫痫高发家系的进行临床遗传学分析、计算后发现，特发性癫痫一级亲属的遗传度为66.98%，介于60%～70%，证明了遗传因素在癫痫的发病中具有明显的作用。这一结论和其他大量癫痫相关的统计学、群体遗传学研究结论相符，均表明遗传因素在癫痫发病机制中不可忽视的作用。据统计，40%的癫痫为遗传因素引起的癫痫。

近年来，电压门控通道的基因突变与癫痫发生的关系引起了研究学者们的关注，包括电压门控钾、钙、氯、钠离子通道和γ-氨基丁酸受体(GABA)和乙酰胆碱受体[3,4]。电压门控钠离子通道(VGSCs)主要负责控制细胞兴奋性，其结构和功能异常可引起细胞膜兴奋性改变，在癫痫发病机制中具有重要作用。电压门控钠离子通道由α和β亚基构成，α亚基由同一家族的基因负责编码，包括SCN1A～SCN11A，分别编码不同的亚型：Nav1.1～Nav1.9。其中，SCN9A基因负责编码Nav1.7[5]。SCN9A基因在机体中对钠离子进入细胞以及神经元之间的交流起导向作用。当SCN9A基因发生突变后，将导致大脑中钠离子通道功能发生改变，并阻碍神经元之间的联系。

Nav编码基因中某些单核苷酸基因多态性不同的等位基因及基因型与癫痫易感性具有相关性[5]。SCN9A基因是第五个被发现能引起热性惊厥的基因[6,7]。研究发现，SCN9A基因不仅分布在外周神经，在中枢神经也有表达，且随着年龄增长，在海马的表达持续增加。2009年,Singh等学者在对定位于2q24 的全面性癫痫伴热性惊厥附加症(GEFS+)家系进行突变分析中，发现了两个SCN9A的突变：I62V 和 P149Q。在对婴儿严重肌阵挛性癫痫(SMEI) 家系进行SCN9A 突变分析时发现，数个患者同时携带SCN9A和SCN1A的突变[8,9]。但迄今为止，SCN9A导致癫痫的机制尚未见相关报道。因此我们选择SCN9A的rs10930210作为筛查位点，以探讨SCN9A基因的SNPs与癫痫发生的内在联系。结果显示，癫痫组与对照组间rs10930210的等位基因分布差异不显著(P>0.05)。结果提示我们，从统计学意义角度考虑，SCN9A基因rs10930210不适合作为癫痫易感性的潜在遗传标记物。

实验结果显示，rs10930210位点多态与癫痫发生无相关性。原因可能是：(1)不同地区、不同民族、不同人群、不同年龄的SNPS发生率存在差异;(2)本研究的研究个数偏少;(3)SCN9A的SNP位点众多。我们将进一步扩大实验样本个数，对SCN9A的多个SNP位点与癫痫发生的相关性进行连锁分析，探讨SCN9A基因多态性与癫痫发生的相关性，为临床上提示癫痫易感性、提早预防以及病情的控制和治疗提供理论依据。

[1]张丽敏,康熙雄,丁成赟.钠离子通道基因多态性在癫痫中的研究进展[J].中华临床医师杂志(电子版),2012,6(22):7324-7326.

[2]唐章龙.89个癫痫高发家系的临床遗传学分析[J].中华临床医师杂志(电子版),2010,8:1208-1211.

[3]周阳.癫痫的遗传学研究进展[J].安徽医科大学学报,2005,50(3):406-410.

[4]宋延民.电压门控钠离子通道与癫痫[J].中华中华临床医师杂志,2011,5(11):3262-3264.

[5]吴江红,任栓成,杨秀明,等.电压门控钠离子通道与癫痫[J].国际病理科学与临床杂志,2013,33(3):240-245.

[6]Yang Y,Wang Y,Li S,et al.Mutations in SCN9A,encoding a sodium channel alpha subunit,in patientswith primary erythermalgia[J].J Med Genet,2004,41(3):171-174.

[7]Miriam H,Meisler M,Janelle E,et al.Sodium channel gene family:epilepsy mutations,gene interactions and modifier effects[J].Physiol,2010,588(11):1841-1848.

[8]Mechaly I,Scamps F,Chabbert C,et al.Molecular diversity of voltagegated sodium channel alpha subunits expressed in neuronal and nonneuronal excitable cells[J].Neuroscience,2005,130(2):389-396.

[9]Singh NA,Pappas C,Dahle EJ,et al.A role of SCN9A in human epilepsies，as a cause of febrile seizures and as a potential modifier of Dravet syndrome[J].PLoS Genet,2009,5:e1000649.

Explore the relationship between SCN9A gene polymorphism and epilepsy

ZOUSonglin,LIXinyu,WUMinggang,etal.

(BasicMedicineDepartmentofJiamusiUniversity,Jiamusi154007,China)

ObjectiveExplore the relationship between SCN9A gene polymorphism and epilepsy.MethodsCollected peripheral blood on 73 cases of normal control and 134 cases of epilepsy patients,and extracted genomic DNA by kits.Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP),sequencing detected rs10930210 polymorphism,comparing the genotypes and allele frequency differences.ResultsSCN9A gene rs10930210 polymorphism loci no significant differences between the epilepsy group and control group (P>0.05).Conclusionrs10930210 polymorphism of SCN9A gene were not associated with epilepsy.

Epilepsy;SCN9A;Single nucleotide polymorphisms

1003-2754(2016)08-0708-03

2016-04-12；

2016-08-02

2015年黑龙江省大学生创新创业训练计划指导项目资助(No.201510222043)；佳木斯大学创新团队项目资助(No.CXTDPY-201602)

(1.佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学科技处，黑龙江 佳木斯 154007；3.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

朱金玲，E-mail：370786436@qq.com

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