茯砖茶褐素组分特征及对α-葡萄糖苷酶活性抑制研究

贺国文，钟桐生，彭晓赟，龙立平，赵运林,3*，章卫民



茯砖茶褐素组分特征及对α-葡萄糖苷酶活性抑制研究

贺国文1,2，钟桐生1，彭晓赟1，龙立平1，赵运林1,3*，章卫民4

1. 湖南城市学院化学与环境工程学院，湖南 益阳 413000；2. 中南大学化学化工学院，湖南 长沙 410083；3. 中南林业科技大学生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004；4. 广东省微生物研究所，广东 广州 510070

采用膜分离技术得到分子质量分别为≤3.5 kDa、3.5~25 kDa、25~50 kDa、50~100 kDa和≥100 kDa的5种茯砖茶褐素，比较了其光谱和理化性质，鉴定出可能存在的39种成分，研究了它们对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的差异。结果显示，茯砖茶褐素具有优越的降糖功效，活性强弱与总酸性基团、羧基、酚羟基、多糖、蛋白质等含量有关。5种茶褐素属酚类物质，均含有羟基、烷基、羧基及苯环，且在230 nm处有一特征吸收峰。多糖含量随着分子量的增加而增加，蛋白质含量反之，活性显示25~50 kDa透出部分对α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，相当于阿卡波糖的1.9倍。推测茯砖茶褐素属苯多酚类，内含多糖、蛋白质等物质，共同构成半椅状或椅状构型。

茯砖茶；茶褐素；组分特征；α-葡萄糖苷酶

茶叶中的很多活性成分有生命保护的功能[1-2]，研究茶中活性成分对于生命健康具有重要意义。茯砖茶是以三级或四级黑毛茶为原料，经微生物固体发酵而成的一种紧压黑茶。由于生产中微生物的参与，使得茶叶原料中以茶多酚为主的化学成分在微生物酶促作用下发生一系列的化学变化，香气具独特陈香，滋味醇厚[3-4]。研究证明茯砖茶水提物对肥胖小鼠有很强的降脂减肥功效[5-6]。体外α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）抑制试验是目前一种较为快捷的降糖药物筛选方法。α-葡萄糖苷酶存在于人体小肠刷状缘上，人体对淀粉、糊精、蔗糖等碳水化合物的利用吸收依赖于小肠刷状缘上该酶的活性[7]。因此，通过寻找并利用合适的α-葡萄糖苷酶抑制剂来与该酶反应从而降低餐后血糖值已成为目前的研究重点。临床证明阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制剂几乎不被机体所吸收，能与α-葡萄糖苷酶的中心活性部位结合而形成游离状态，从而抑制酶活，阻滞双糖水解为单糖，有效推迟并减轻餐后血糖升高的时间及进程[8]，同时α-葡萄糖苷酶与酶抑制剂的产物能以原型排出体外或者在大肠内经细菌发酵成挥发气体排出体外[9-10]。目前，已发现植物中的多糖及糖苷类、黄酮类、生物碱类、酚酸类和萜类等具有很好的降血糖效果。如茶叶中水溶性复合多糖具有很好的降血糖作用[10]，降血糖的有效成分与色素物质有密切关系[11]。

茶褐素是发酵茶中主要的色素类物质，是茶多酚、茶黄素和茶红素被氧化和聚合的最终产物，是一类分子差异极大的复杂高聚合物[12]。目前对于茶褐素的研究多集中在普洱茶和红茶方面[13-15]，而对于茯砖茶褐素的组分特征和活性研究鲜见报道，本文对茯砖茶中茶褐素进行提取和纯化，并对其光谱学性质、理化性质和降糖性能进行研究，以明确茯砖茶中茶褐素的基本化学组成和活性基团，可望为阐明茯砖茶褐素的生理活性及其应用提供价值参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

茯砖茶购自湖南益阳茶厂，牛血清蛋白、α-葡萄糖苷酶、对-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷购自Sigma公司，阿卡波糖购自TCI，96孔板为Corning Costa。葡聚糖、无水乙醇、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、过氧化氢、浓盐酸、氢氧化钠、氯化钡、醋酸钙、考马斯亮蓝G250均为国产分析纯。

紫外可见近红外分光光度计（UV-3010，日本岛津）；红外光谱仪（370FT-IR，美国热电）；电热鼓风干燥机（天津市泰斯特仪器）；自动电位滴定仪（ZD-2A，上海宇通仪器）；酶标仪（MULTISKAN FC，美国热电）；Bruker DRX500交叉极化魔有旋转核磁共振仪，采用D2O作溶剂。

1.2 茶褐素的提取纯化

根据茶褐素溶于水，不溶于乙酸乙酯和正丁醇等有机溶剂的特性[13-14]，依次去掉茶褐素中夹带的茶黄素、茶红素和皂甙，对茯砖茶褐素进行逐级纯化，具体步骤见图1。

1.3 茶褐素理化性质检测

纯化后茶褐素样品的紫外可见吸收光谱（UV-vis）分析：分别称取0.01 g茶褐素分级样品溶于100 mL蒸馏水中，配置成质量浓度为0.1 g·L-1的溶液，于200~800 nm波长范围内扫描。

纯化后茶褐素样品的化学结构检测：茶褐素经KBr压片，于傅立叶变换红外光谱仪扫描分析，扫描波数范围500~4 000 cm-1，分辨率8 cm-1，扫描次数16。液体核磁共振分析：取样品约10 mg于核磁管，加入氘代试剂D2O上机测试。

1.4 茶褐素成分检测

茶褐素成分采用居里点热裂解气质联用（CP-GC/M）分析：将样品包裹于JHP-5热箔片中，热裂解温度为255℃，时间5 s，进样针温度为280℃，采用Agilent公司HP-5色谱柱或DB-5色谱柱。GC分析采用一级程序升温，60℃下停留2 min，以30℃·min-1升温至120℃，保持1 min，再以25℃·min-1升温至250℃，保持10 min。检测器温度为280℃，载气为氦气，流量为20 mL·min-1，分流比100∶1。质谱条件为电离源电子能量70 eV，离子源温度230℃，扫描范围为15~500 U。

1.5 茶褐素中基团的测定

总酸性基、茶褐素羧基、茶褐素酚羟基的测定参照文献[16]，多糖的测定采用苯酚-硫酸法[17]，蛋白质采用考马斯亮蓝法[18]测定, 茶褐素分级样品抑制α-葡萄糖苷酶的效果采用96微孔板试验方法测定[19]。

2 结果与讨论

2.1 茯砖茶褐素不同分子质量产品的光谱学性质

2.1.1 UV-vis分析结果

所有透析产物在230 nm处附近有吸收肩峰，且紫外区段随波长减小吸收值迅速上升。其中吸光度的强弱表现为：3.5 kDa透出部分＞3.5~25 kDa透出部分＞25~50 kDa透出部分＞50~100 kDa透出部分＞100 kDa未透出部分，结果见图2。

2.1.2 茶褐素的化学结构

所有透析产物的红外谱图表现出一致性，在3 420 cm-1处的强吸收峰为-OH的伸缩振动峰，存在分子间和分子内的氢键，在3 000~ 3600 cm-1出现的宽峰还可能包含N-H伸缩振动，2 930 cm-1处为烷基的-CH2伸缩振动峰，1 625 cm-1处为C=O的伸缩振动峰，1 409 cm-1处为COO-的对称伸缩振动峰，1 313 cm-1处应为芳香族C-N的伸缩振动峰，1 240 cm-1处为酚类的C-O伸缩振动峰，1 095 cm-1处为C-O-C的伸缩振动峰，780 cm-1处为苯环上C-H面外弯曲振动，结果见图3。由此可知，茶褐素为多羟基酚类物质，并含有羧基，可能含有蛋白质和与其结合的多糖。与秦谊等[12]对普洱茶茶褐素的红外光谱研究有一定的相似性，说明两种发酵茶中的茶褐素具有相同的官能团。但更确切的基团情况，如联接方式、基团数目、有无分支等尚需其他相关分析。

2.2 茯砖茶褐素的核磁共振分析和主要组分结构表征

为了表征茯砖茶褐素的基团信息，对茶褐素进行核磁共振分析（1H-NMR和13C-NMR），结果见图4。可以看到，没有进行膜分离的茶褐素和分子量在25 kDa＜M≤50 kDa的茶褐素在l~2 mg·kg-1为甲基及亚甲基H峰，3.2~4.8 mg·kg-1之间的峰呈现糖类物质特有的H峰，4.8 mg·kg-1为水峰，6~7 mg·kg-1出现微凸状峰（图4-a、图4-b），此处多为苯环峰，表明该物质含大量苯环，但分子量大于100 kDa的茶褐素的1H-NMR没有出现特征氢峰（图4-c），分子量为25 kDa＜M≤50 kDa的茶褐素的13C-NMR（图4-d）未见吸收峰，主要是因为该物质聚合度较大，其次在氘代试剂中溶解性变差。

鉴于茯砖茶褐素属于非常复杂的组合物，核磁技术不能完全解析茶褐素的基团信息，精细结构很难明确。在本研究中，选取分子量为25 kDa＜M≤50 kDa的茶褐素作为研究对象，首先将其进行居里点热裂解，再采用气相色谱-质谱联用（GC/MS）对裂解产物进行检测。理想情况下，热解条件应足够温和以使热解产物更好地保持原来的结构。但是太温和的温度下，可能裂解不完全，无法产生理想的热解产物。相反，过高的裂解温度会将一些物质分解成水、二氧化碳等小分子物质。因此，本研究中采用较为适宜的裂解温度255℃进行实验，图5为分子量为25kDa＜M≤50 kDa的茯砖茶褐素的热裂解总离子色谱图。依据图中的信息进行解析，对相似度>65%的裂解成分进行鉴定，共鉴定出39种可能存在的化合物，其中第29、32、34和36四个物质均与17-三十五烯烃有很大的相似度（超过77%），可分别定义为类17-三十五烯烃（一、二、三、四），参见表1。从这些物质可以看出茶褐素中含有多苯环类物质、多酚类物质、烯烃类物质和酯类。

2.3 茯砖茶褐素不同组分的基团成分分析

茯砖茶为黑茶的一种，是由黑毛茶杀青后在其发酵过程中由多种微生物以及在加工过程中的高温高湿作用下，发生了茶多酚的氧化和缩合、蛋白质和纤维素等大分子的分解及氨基酸、咖啡碱、糖类等各成分之间的聚合、缩合等一系列的复杂反应而形成的[20]。由表2可知，茯砖茶褐素中含有大量的羧基、酚羟基等活性基团，其中50~100 kDa透出部分的总酸性基团、羧基、酚羟基含量最高，＞100 kDa未透出部分次之，其次为＜3.5 kDa、25~50 kDa、3.5~25 kDa。本研究与张钦等[11]对普洱茶茶褐素膜分离产品的理化性质研究有较大相似性。研究发现羧基、酚羟基均为茶褐素的活性基团，与茶叶药理活性及品质之间有重要关系[16]。同时，多糖含量随着分子质量的增大逐渐增多，以＞100 kDa未透出部分最多，达到0.14%。而蛋白质含量则随着样品分子质量的增大而减少，以＜3.5 kDa透出部分最多，含量为7.55%。推测其原因是多糖、蛋白质及茶褐素三者均为大分子高聚物，多糖、蛋白质对茶褐素的结合可能为竞争性结合。

2.4 茯砖茶褐素不同组分对α-葡萄糖苷酶活性的影响

小肠黏膜上皮的α-葡萄糖苷酶能够水解蔗糖、麦芽糖等寡糖类的α-1,4-糖苷键，而α-葡萄糖苷酶抑制剂可逆性竞争抑制小肠粘膜刷状缘α-葡萄糖苷酶的活性，降低淀粉、蔗糖、麦芽糖的分解，使葡萄糖的生成和吸收减缓，使餐后血糖曲线较为平稳。从而降低餐后血糖峰值，减少血糖对胰腺的刺激，提高胰岛素的敏感性，保护胰腺的功能，有效预防并改善高血糖并发症的发生和发展，因此对Ⅱ型糖尿病的预防和治疗具有积极作用[21]。

表3为不同分子量的茶褐素及阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，很明显，5种不同分子量透出部分的茶褐素对α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用。总体来看，5种产品均对α-葡萄糖苷酶的抑制作用呈显著剂量关系，随着反应体系中浓度的增加，抑制率均呈极显著上升（＜0.01）。其中25 kDa＜M≤50 kDa、50 kDa＜M≤100 kDa及3.5 kDa＜M≤25 kDa透出部分对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度分别为240 μg·mL-1、290 μg·mL-1及380 μg·mL-1，均低于阿卡波糖的454 μg·mL-1，显示出了很好的降糖效果。

3 小结与讨论

茯砖茶褐素主要是由酚和羧酸类物质构成，是由多酚类进一步氧化、聚合而成，同时有糖类、蛋白质等非酚类物质参与，在结构上为苯多酚类化合物。本研究共鉴定出39种可能存在的多苯环类物质和多酚类化合物。5种不同分子量级的茶褐素产品均表现出了优越的降糖性能，其中25~50 kDa透出部分对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用最强，降糖效果优于阿卡波糖。在今后茶褐素功能产品的开发中可以根据产品的需求对其进行不同分子质量截取，为黑茶的深度开发提供价值参考。

α-葡萄糖苷酶活性中心是由甘氨酸或天冬氨酸提供的-COOH相互连接起来的4个亚基，α-葡萄糖苷酶与糖反应时先形成糖-酶中间体，-COOH会与异头碳结合形成碳氧锚离子过渡态，并且糖苷环上的其他-OH也会与酶的多种氨基酸之间形成氢键，通过静电作用保持过渡态的稳定性，然后通过亚基间的酸性进行酸碱催化及亲核作用，形成碳阳离子过渡态物质，最终使糖水解[22]。因此有研究指出α-葡萄糖苷酶对底物或抑制剂的结构要求较为严格，好的α-葡萄糖苷酶抑制剂应该是酶-底物反应的中间体或碳氧锚离子过渡态类似物，需要有恰当的羟基构象、阳离子、三角形的异头碳中心，并且有1个共价连接的环所形成的半椅状或椅状构型[23]。因此，结合本研究结果，推测茶褐素可能也具有半椅状或椅状构型。

[1] 赵亚华, 桑守强, 余霜, 等. 普洱茶水溶性茶色素降脂减肥作用研究[J]. 西南农业学报, 2014, 27(3): 1256-1259.

[2] 卿春华, 陈平, 向旭东. 茶多酚对低剂量烟草悬凝物诱导人支气管上皮细胞氧化损伤及凋亡的影响[J]. 中南大学学报: 医学版, 2010, 35(2): 123-128.

[3] 彭晓赟, 章卫民, 刘淑云, 等. 湖南地区茯砖茶中金花菌的分离鉴定[J]. 菌物研究, 2011, 9(3): 157-161.

[4] 彭晓赟, 赵运林, 何小书, 等. 茯砖茶茶叶品质和保健功能的研究概况[J]. 湖南城市学院学报: 自然科学版, 2011, 20(4): 45-48.

[5] 熊昌云, 屠幼英, 欧阳梅, 等. 人工接种发酵茯砖茶降脂减肥作用研究[J]. 菌物学报, 2011, 30(2): 349-354.

[6] 傅冬和, 刘仲华, 黄建安, 等. 茯砖茶不同萃取物对消化酶活性的影响[J]. 茶叶科学, 2008, 28(1): 62-66.

[7] Asano N, Nishida M, Kizu H, et al. Homonojirimycin isomers and glycosides from aglaonematreubii [J]. Journal of Natural Products, 1997, 60 (2): 98-101.

[8] Xiao S Z. a-glucosidase inhibitor [J]. Japanese Journal of Physical Fitness and Sports Medicine, 1999, 20(1): 22-24.

[9] 张钟, 吴文婷, 王萍, 等. 荔枝水溶性多糖作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的活性测定[J]. 食品科学, 2013, 34(13): 175-179.

[10] 汪东风, 谢晓风, 王泽农. 等. 粗老茶中的多糖含量及其保健作用[J]. 茶叶科学, 1994, l4(1): 73-74.

[11] 张钦, 董立星, 李改青, 等. “紫娟”普洱茶茶褐素的膜分离及其理化性质的初步研究[J]. 茶叶科学, 2012, 32(3): 189-196.

[12] 秦谊, 龚加顺, 张惠芬, 等. 普洱茶茶褐素提取工艺及理化性质的初步研究[J]. 林产化学与工业, 2009, 29(6): 95-98.

[13] Gong J S, Tang C, Peng C X. Characterization of the chemical differences between solvent extracts from pu-er tea and dian hong black tea by CP-Py-GC/MS [J]. Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 2012, 95(1): 189-197.

[14] Wang Q P, Peng C X, Gong J S. Effects of enzymatic action on the formation of theabrownin during solid state fermentation of pu-erh tea [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2011, 91(13): 2412-2418.

[15] Gong J S, Peng C X, Chen T, et al. Effects of theabrownin from pu-erh tea on the metabolism of serum lipids in rats: mechanism of action [J]. Journal of Food Science, 2010, 75(6): 182-189.

[16] 秦谊, 龚加顺, 张惠芬, 等. BaCl2和Ca(CH3COO)2沉淀法定量分析普洱茶茶褐素官能团[J]. 林产化学与工业, 2010, 30(6): 107-112.

[17] 黄意欢. 茶学实验技术[M]. 北京: 中国农业出版社, 1997: 125-127.

[18] 杨大鹏, 史文斌, 陈一江, 等. 不同微生物发酵的云南普洱茶样中茶褐素提取物的化学成分分析[J]. 林产化学与工业, 2010: 30(1): 49-52 .

[19] Feng J, Yang X W, Wang R F. Bio-assay guided isolation and identification of a-glucosidase inhibitors from the leaves of Aquilaria sinensis [J]. Phytochemistry, 2011, 72(2/3): 242-247.

[20] 傅冬和, 刘仲华, 黄建安, 等. 茯砖茶加工过程中主要化学成分的变化[J]. 食品科学, 2008, 29(2): 64-67.

[21] 李昌勤, 卢引, 顾雪竹, 等. 6种栽培品种南瓜提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性的研究[J]. 食品工业科技, 2012, 33(21): 93-95.

[22] 郭凤霞. 沙棘中a-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选[D]. 西宁: 青海师范大学, 2010: 8.

陈海敏, 严小军, 林伟. α-葡萄糖苷酶抑制剂的构效关系[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2003, 19(6): 780-784

Comparative Study on Component Characteristics and Inhibitory Activities on α-glucosidase of Theabrownin from Fuzhuan Brick Tea

HE Guowen1,2, ZHONG Tongsheng1, PENG Xiaoyun1, LONG Liping1, ZHAO Yunlin1,3*, ZHANG Weimin4

1. College of Chemical and Environmental Engineering, Hunan City University, Yiyang 413000, China; 2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Central South University, Changsha 410083, China; 3. College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China; 4. Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China

By using Fuzhuan brick tea as raw material, five kinds of theabrownin with different molecular weight (≤3.5 kDa、3.5-25 kDa、25-50 kDa、50-100 kDa and ≥100 kDa) have been obtained by membrane separation technology. The spectral and physicochemical properties and inhibition on the α-glucosidase activity of theabrownins were comparative studied. The results showed 39 components from pyrolysis of Fuzhuan theabrownines were identified. The results showed that the theabrownins possessed the advantageous hypoglycemic effect. Effects of biological activity influenced by the total content of acidic group, carboxyl, phenolic hydroxyl, polysaccharide and protein. Five kinds of theabrownin belong to phenolic compounds containing hydroxyl, alkyl, carboxyl and phenyl, and showed a characteristic absorption peak at the 230 nm in UV-vis spectrum. The polysaccharide contents increased with the increase of theabrownin molecular weight, while the protein decreased. The theabrownin with

molecular weight 25-50 kDa showed highest inhibition rate to α-glucosidase, which is equivalent of 1.9 times to that of acarbose. It is suggested that the Fuzhuan brick theabrownine is a benzene substance containing polyphenols, polysaccharides and proteins, which constitute a half chair or the chair conformation.

Fuzhuan brick tea, theabrownine, component characteristics, α-glucosidaseinhibitory

TS272.5+4；Q946.5

A

1000-369X（2016）01-102-09

2015-07-02

2015-08-12

湖南省教育厅一般项目（12C0576）、湖南省科技计划重点项目（2012WK2013）、湖南省应用基础研究基地科研基金资助项目（湘科计字[2012]154号）、湖南省高校科技创新团队支持计划资助项目（湘教通[2014]207号）。

贺国文，男，博士，副教授，主要从事中草药活性功能成分和有机功能材料的研究。*通讯作者：zyl8291290@163.com