山参磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶cDNA克隆及序列分析

冯　凯,李　胜,2,麻　锐,姜　锐,孙立伟,陈　伟，*

(1.吉林省中药科技创新中心,北华大学化学与生物学院,吉林吉林 132013；2.东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心,东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150040)



山参磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶cDNA克隆及序列分析

冯凯1,李胜1,2,麻锐1,姜锐1,孙立伟1,陈伟1，*

(1.吉林省中药科技创新中心,北华大学化学与生物学院,吉林吉林 132013；2.东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心,东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150040)

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)具有明显的抗氧化活性,避免细胞膜受到过氧化损伤。本研究利用RACE技术,克隆出山参phgpx基因全长cDNA。序列分析表明:该克隆片段全长490 bp,编码162个氨基酸,有3个真核生物PHGPx特有的保守亚结构域。该片段编码的蛋白为跨膜亲水性稳定蛋白质,与柑橘、蓖麻等PHGPx氨基酸序列同源性分别为76%和75%。同时建立了9种植物的系统进化树。

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶,基因克隆,山参

人参(PanaxginsengC.A. Mey)是草本药食同源植物,《神农本草经》中记载着其药用精髓:“主补五脏,除邪气,久服,轻身延年”。现代学者用先进的技术手段考察验证并确认其记载的人参药效正确,人参确有降血糖[1]、抗疲劳[2]、抗氧化[3]、抗肿瘤[4]、抗衰老[5]、提高免疫力[6],提高认知力[7]和调节血脂异常[8]等多种药用功效。

目前广泛认为造成人体衰老的最主要原因之一是活性氧累积所造成的过氧化损伤[9]。人参有延年益寿的功效,因其含较高的抗氧化、抗衰老等活性成分[10]。山参又称野山参,与栽培人参属同种,山参生长年限长,生长环境较为苛刻,但积累SOD等成分多于园参,这些研究显示山参在抗氧化等方面远高于园参[11-13]。

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(Phospholipid Hydroperoxide Glutathione Peroxidase,简称PHGPx)是谷胱甘肽过氧化物酶家族(GPX)中的一类较小的单亚基球状蛋白[14],也是体内唯一一种能够减少细胞膜氧化损伤的过氧化物酶[15-16]。PHGPX是最初从鼠和猪中分离纯化出的一种“过氧化作用抑制蛋白”[17],对植物phgpx基因的研究首次出现在柑橘中[18],目前仅在烟草[19],苦瓜[20],萝卜[21]等植物中有该基因的研究报道。人参是传统中药植物,具有明显的抗氧化等功效,但目前没有关于编码人参抗氧化活性的phgpx基因的研究报道。本文首次使用RACE PCR克隆技术,克隆出山参phgpx基因,通过该基因片段的特性分析,与其他同源植物基因的同源性分析,以期为山参及其它相近植物的基因克隆及抗氧化机制的研究提供参考和依据。

1　材料和方法

1.1材料与仪器

30年山参,采自于吉林省白山市抚松县沿江乡楞场村(北纬42°48′1″东经127°46′18″)。经长春中医药大学中药鉴定教研室鉴定,其为五加科植物人参,符合《2010版中华人民共和国药典》(一部)的规定。pGM-T Tiangen产品;大肠杆菌菌种(Escherichiacoli)DH5α本实验室保存菌种;3′-Full RACE Core Sets with PrimeScriptTM RTase试剂盒,5′-Full RACE Kit with TAP试剂盒,凝胶回收试剂盒,质粒提取试剂盒TaKaRa产品;DNA marker DL2000Promega产品;氨苄青霉素、IPTG和X-gal主要生化与分子生物学试剂宝泰克产品。DNA测序由上海生工公司完成。

1.2实验方法

1.2.1山参cDNA第一片段的合成山参总RNA提取方法参照林燕玲改进的Trizol方法进行[22]。以山参总RNA为模版,进行cDNA的反转录扩增。反转录程序为:30 ℃ 10 min,42 ℃ 30 min,99 ℃ 5 min。根据已报道的基因保守序列设计兼并引物A:5′-tcaag/atggaacttt/ctccaagtt-3′、引物B:5′-atccttctca/gatgctc/aagagg-3′。以反转录获得的cDNA为模版,用引物A、B扩增目的基因第一片段。PCR产物经回收后连接在pGM-T载体上转化大肠杆菌,在含有氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB培养基中进行蓝白斑筛选,挑取白斑培养,提取质粒后送去测序。

1.2.2目的基因的3′RACE克隆据第一片段序列信息,设计3′ RACE outer 引物:5′-acttttccaagtt cctggtgg-3′;inner 引物:5′-agatggcaatgttgtcgatcg-3′,分别与3′-Full RACE试剂盒下游引物配合,以山参总RNA为模板进行3′ RACE的outer PCR和inner PCR程序,程序按照说明书进行,PCR产物回收后经TA克隆后送去测序。

1.2.3目的基因的5′ RACE克隆据第一片段序列信息,设计5′ RACE outer 引物:5′-agcgatcgacaa cattgccatc-3′;inner 引物:5′-accttctcgatgctcagaggagag-3′;以山参总RNA为模板,参照5′-Full RACE说明书进行5′ RACE的outer PCR和inner PCR程序,PCR产物回收后经TA克隆后送去测序。

1.2.4序列拼接和分析使用工具EMBOSS(http://emboss.bioinformatics.nl/)对序列进行人工拼接。用工具ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)、ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/),NCBI CD-Search service(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi),SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和DNAStar7.10(美国DNAstar公司)、DNAMAN5.2(美国Lynnon Biosoft公司)等软件对序列进行分析,用MEGA 6.0软件构建系统进化树。

2　结果与分析

2.1山参phgpx基因的PCR扩增

经RACE方法克隆出的山参PHGPx基因经0.8%琼脂糖凝胶电泳,检测结果如下,5′RACE回收产物大约50 bp(图1A),3′RACE回收产物大约460 bp(图1B)。

图1　RACE PCR电泳图 Fig.1　RACE PCR electrophoresis 注:Marker:DL2000,图A 1:5′RACE产物,图B 1:3′RACE产物。

目的基因片段同T载体连接、转化、鉴定后取阳性克隆送去测序。测序结果用在线工具EMBOSS 拼接,拼接得到山参PHGPx(PgPHGPx)基因全长序列为490 bp含有一个起始密码子ATG和一个终止密码子TAG,编码162个氨基酸。

2.2山参PHGPx基因的蛋白特性分析

利用在线工具ProtParam对PgPHGPx氨基酸序列进行理化特性分析,结果表明PgPHGPx的分子量为18.0375 ku,理论等电点为8.56。其中极性氨基酸(Trp、Tur、Ser、Cys、Met、Asn、Gln、Thr、Asp、Gly、Lys、Arg、His)54.3%,蛋白质不稳定指数估算值为28.5,属于稳定蛋白类。

2.3山参PHGPx基因保守结构域和氨基酸序列分析

利用NCBI CD-Search service工具对PgPHGPx蛋白质的结构域分析表明,其含有谷胱甘肽过氧化物酶GSH-peroxidase结构域和类似硫氧还蛋白类超家族结构,在第41个氨基酸位置具有催化残基(图2)。应用DNAMAN5.2进行phgpx基因的氨基酸序列同源性比较,结果表明,不同植物phgpx基因同源性差异较大,山参phgpx基因与柑橘(Citrushybridcultivar,ABL67656.1)、蓖麻(Ricinuscommunis,XP_002509790.1)、菠菜(Spinaciaoleracea,BAA22194)的phgpx基因氨基酸同源性分别为76%、75%、70%,均含有PHGPx特有的3个保守的亚结构域(图3)。植物物种的不同,其体内的磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶的同源性也会较低(大约50%～80%),这一结果明显比动物磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶同源性(90%以上)低很多,这或许是在表明植物在进化的过程中,其磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶也出现了相应的功能分化[22]。

图2　PgPHGPx结构域分析Fig.2　Analysis of PgPHGPx domain

图3　PgPHGPx与其他植物的PHGPx的氨基酸序列比较Fig.3　Comparison of PHGPx amino acid sequencesbetween PgPHGPx and other plants

用ProtScale程序对PgPHGPx亲水性预测表明,PgPHGPx氨基酸亲水性残基所占比例大于疏水性残基,数值为-11.3(图4),因此可以推测该酶是亲水性的,其疏水性氨基酸主要作用与疏水性底物PLOOH结合,这与前人其他物种的该酶报道一致[14]。

图4　PgPHGPx亲疏水性预测分析Fig.4　PgPHGPx hydrophilicity predictive analysis

二级结构预测由SOPMA来完成。结果表明该蛋白含有16.67%的α-螺旋,29.01%的延伸链,13.58%的β-转角和40.74%的无规则卷曲(图5)。

图5　PgPHGPx蛋白序列的二级结构预测Fig.5　Secondary structure prediction of PgPHGPx protein sequence

2.4山参PHGPx系统进化树分析

将PgPHGPx与其他植物的磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶进行氨基酸水平的聚类分析(图6)。系统进化树除山参外还包括柑橘(Citrushybridcultivar,ABL67656.1)、杨树(Populustrichocarpa,XP-002299536)、蓖麻(Ricinuscommuris,XP-002509790)、菠菜(Spinaciaoleracea,BAA22194)、水稻(Oryzasativa,NP-001057006)、大豆(Glycinemax,ACU14410.1)、大黄(Rheumaustrale,ACH63236.1)、高粱(Sorghumbicolor,XP-002436614)和拟南芥(Arabidopsisthaliana,NP-194915.2)等9种植物。系统进化树分析表明,山参磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶与大戟科植物蓖麻的磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(XP-002509790)同源性较近,说明它们具有类似的结构和功能,这与前人报道也一致[14]。

图6　山参PgPHGPx与其他植物PHGPx的进化Fig.6　Evolutionary of PgPHGPx and other plants PHGPx

3　结论

山参磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶含有真核生物磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶所特有的3个亚结构域,是稳定蛋白,其亲水性残基所占比例远大于疏水性残基,因此可以推测该酶是亲水性的。这些数据为山参磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶对抗氧化作用的强弱分析提供了依据,丰富了山参相关活性酶对损伤细胞的修复、免疫调节等方面的基因库。通过氨基酸序列建构系统进化树,显示山参与其他植物的同源关系,这些数据为以后其他植物phgpx基因克隆提供了理论依据。

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Cloning and sequence analysis of wild ginseng phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase cDNA

FENG Kai1,LI Sheng1,2,MA Rui1,JIANG Rui1,SUN Li-wei1,CHEN Wei1,*

(1.Science and Technology Innovation Center of Jilin Traditional Chinese Medicine,College of Chemistry and Biology,Beihua University,Jilin 132013,China;2.Alkali Soil Natural Environmental Science Center,Northeast Forestry University,Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration in Oil Field(SAVER),Ministry of Education,Harbin 150040,China;)

Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase(PHGPx)has significant antioxidant activity,avoiding the harm by peroxidation in the cell membrane. To clone the full-length cDNA encodingPHGPxgene from Panax ginseng,the RACE technology was used in this study. The sequence analysis showed that:the full length of the cloned fragment was 490 bp. It encoded 162 amino acids and contained 3 sub-conservative domains which were specific in eukaryonic phospholipid hydroperodixe glutathione peroxidase. The encoding protein was a stable non-transmembrane hudrophilic protein. The sequence of amino acids was similar with PHGPx of citrus and castor,homologous rates of amino acids were 76% and 75%. And then,the phylogenetic tree of nine plants was constructed.

Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase;gene clone;Panax ginseng

2015-11-05

冯凯(1976-),男,硕士,讲师,研究方向:植物分子生物学,E-mail:fengk544@163.com。

陈伟(1983-),女,博士,讲师,研究方向:植物分子生物学,E-mail:chenw352@126.com。

吉林省科技发展计划项目(201201144)；吉林省人参转化关键技术研究与应用创新团队(20140519016JH)；吉林省中药生物技术科技创新中心(20130604039TC)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)11-0152-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.023