凉州熏醋酿造过程产乙偶姻酵母菌筛选及其发酵培养基优化

赵风琴,贠建民,赵小瑞,李宏珍,贾亚莉

(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070)



凉州熏醋酿造过程产乙偶姻酵母菌筛选及其发酵培养基优化

赵风琴,贠建民*,赵小瑞,李宏珍,贾亚莉

(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州 730070)

乙偶姻是凉州熏醋特征风味成分四甲基吡嗪的前体。本实验从凉州熏醋发酵料醅中分离获得了一株产乙偶姻酵母菌T8,通过经典鉴定方法结合ITS基因测序的方法,确定其为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)。为探明T8菌株生长及代谢产乙偶姻的营养需求,本实验对产乙偶姻酵母菌T8发酵培养基进行了优化,以期为传统食醋酿造工艺现代化改造过程中人工接种增香酵母种子的制备提供培养基。通过研究不同碳源、氮源、无机盐对T8菌株产乙偶姻的影响,确定了发酵培养基的最终组分:葡萄糖60 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母膏10 g/L,(NH4)2HPO48 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.75 g/L,MnSO40.6 g/L。培养基优化后,乙偶姻产量达到15.236 g/L,与初始发酵培养基相比提高了20.65%。人工接种T8菌株种子液所酿食醋中四甲基吡嗪的含量较对照提高了22.1%,增香效果明显,证明H.UvarumT8菌株可以作为食醋酿造的增香酵母。

食醋酿造,乙偶姻,酵母菌,发酵培养基,优化

凉州熏醋是甘肃名优产品,采用传统固态发酵技术,经糖化、酒精发酵和醋酸发酵三个阶段酿造而成[1]。四甲基吡嗪是凉州熏醋特征风味成分,它与其它挥发性成分共同作用,形成了凉州熏醋酸不涩口、醇厚绵长、浓郁和谐、口感柔和的品质特点[2-3]。

研究报道表明,乙偶姻是四甲基吡嗪的前体物质,可由微生物代谢产生,具有奶香味,是一种重要的食品风味物质,广泛存在于多种发酵食品中[4]。目前已报道的产乙偶姻微生物多为细菌,如醋酸菌(Acetobacter)、乳球菌(Galactococcus)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、沙门氏菌(Salmonella)等[5-6],但有关酵母菌产乙偶姻的研究报道相对较少。而酵母菌是凉州熏醋酒精发酵阶段的主要功能菌,除了代谢生产酒精外,对食醋风味的形成也至关重要[7]。因此,筛选高产乙偶姻酵母菌及人工接种增香酵母是提高传统食醋风味的可能途径,探明产乙偶姻酵母菌株在菌体生长及代谢过程的营养需求显得非常重要,可为增香菌株的人工接种种子液的制备提供理论依据。

为此,本实验依据微生物营养学基本原理,采用单因素及正交设计,拟对所分离酵母菌T8产乙偶姻发酵培养基进行优化研究,旨在为凉州熏醋酿造过程酒精发酵阶段人工接种增香酵母菌种子液的制备提供优良的培养基,以期实现传统食醋酿造工艺的现代化改造，改善食醋的风味和品质。

1　材料与方法

1.1材料及仪器

凉州熏醋发酵第3 d酒醅由甘肃益民食品有限公司提供。

酵母菌分离培养基(YEPD):葡萄糖20 g,酵母膏10 g,蛋白胨20 g,琼脂20 g,蒸馏水1000 mL,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min,备用。

初始发酵培养基:葡萄糖80 g,酵母膏20 g,蛋白胨10 g,KH2SO41 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,(NH4)2SO42 g,MnSO40.2 g,蒸馏水1000 mL,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

DH-600A台式恒温振荡器上海跃进医疗器械厂;SW-CJ-1FD洁净工作台苏州安泰空气技术有限公司;PHS-3C型pH计上海佑科仪器仪表有限公司;HHS型电热恒温水浴锅上海博讯实业有限公司医疗设备厂;UV756CRT紫外可见分光光度计上海佑科仪器仪表有限公司;FA1004B电子天平上海佑科仪器仪表有限公司;101-1-S-Ⅱ电热恒温培养箱北京科伟永兴仪器有限公司;YX280B手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器上海三申医疗器械有限公司;GC 6890N 气相色谱仪、DB-WAX 色谱柱美国 Agilent scientific公司;顶空固相微萃取装置、DVB/CAR/PDMS萃取器美国surpelco公司。

1.2实验方法

1.2.1菌种分离纯化采用梯度稀释平板法对所需菌株进行分离[8]。采用分光光度法结合气相色谱法[9]测定所分离菌株初始发酵培养基中乙偶姻的含量,筛选出产乙偶姻最高的菌株。

1.2.2菌种鉴定形态学及生理生化鉴定参照《酵母菌特性及鉴定手册》[10],采用经典鉴定方法,通过菌体形态观察,子囊孢子、掷孢子、假菌丝的形成,以及相应的生理生化实验对菌株进行鉴定。

将提取的基因组DNA委托甘肃金博研生物科技有限公司进行ITS序列扩增测序。测序结果提交GenBank数据库,将得到的基因序列通过BLAST程序提交,NCBI数据库中进行同源序列检索[11]。将目标菌株和应用Blast检索到的与之较高的同源性菌株的ITS序列作最大同源性比较分析。

1.2.3发酵培养基优化固定因素装液量50 mL/250 mL锥形瓶,接种量10%(v/v),30 ℃、150 r/min培养72 h,对培养基进行优化。

挑取一环新鲜的斜面菌种,接入液体YEPD培养基中,装液量50 mL/250 mL,30 ℃、150 r/min培养72 h,4 ℃保藏备用。

在初始发酵培养基基础上,分别选取淀粉、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖为单一碳源,以80 g/L的添加量配制发酵培养基,测定发酵液中生物量和乙偶姻含量,研究不同碳源对T8发酵产乙偶姻的影响;设置碳源浓度为0、20、40、60、80、100、120 g/L,测定发酵液中还原糖、生物量、乙偶姻含量,筛选最佳碳源浓度;分别选取玉米浆、蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、硝酸铵为单一氮源,以20 g/L的添加量配制发酵培养基,测定发酵液中生物量和乙偶姻含量,研究不同氮源对T8发酵产乙偶姻的影响;设置酵母膏/蛋白胨含量为10 g/10 g(1∶1)、10 g/20 g(1∶2)、15 g/10 g(1.5∶1)、15 g/20 g(1.5∶2)、20 g/10 g(2∶1),测定发酵液中生物量和乙偶姻含量,确定复合有机氮源的最佳比例。在发酵培养基中添加不同浓度的(NH4)2HPO40、2、4、6、8、10 g/L进行实验,测定发酵液中pH、生物量和乙偶姻含量,研究(NH4)2HPO4对T8发酵产乙偶姻的影响。

根据微生物生长代谢以及产乙偶姻的营养要求[12,14],选取KH2PO4、MgSO4·7H2O、MnSO4为无机盐配置发酵培养基,采用正交实验设计研究K+、Mg2+、Mn2+对T8产乙偶姻的影响,因素水平表见表1。

表1　正交实验因素水平表(g)

1.2.4分析方法(1)乙偶姻的测定方法:肌酸甲萘酚法[13-14]

乙偶姻含量计算公式为

其中:V-样本体积,n-稀释倍数。

(2)还原糖含量测定:采用3,5-二硝基水杨酸比色法[15];

(3)pH测定:采用pH计对发酵液pH进行测定;

(4)生物量的测定:恒重法[16];

(5)四甲基吡嗪的测定方法:气相色谱-质谱法(GC-MS)[17]。

1.3数据统计分析

使用Excel 2010软件处理数据,计算标准偏差(±SE)并绘制折线图、柱形图。使用SPSS 19.0进行正交分析以及单因素方差分析(p<0.05为差异显著)。

2　结果与分析

2.1分离筛选结果

将从凉州熏醋发酵第3 d酒醅中分离获得的176株酵母菌分别接入初始发酵培养基中,装液量为50 mL/250 mL三角瓶,30 ℃培养72 h。发酵结束后将发酵液8000 r/min离心10 min,采用分光光度法测定各菌株发酵液中乙偶姻含量,选取发酵液中乙偶姻含量较高的前20株菌株采用气相色谱(GC)进行二次发酵筛选,检测发酵液中乙偶姻的含量,以不接种的样品为对照,其中T8菌株发酵产乙偶姻的含量最大,达到11.642 g/L。

表3　T8菌株基因比对结果

2.2菌株鉴定

2.2.1菌株形态学及生理生化鉴定根据表2实验结果,查阅《酵母菌特性及鉴定手册》,对已分离的T8酵母菌株进行初步鉴定,属于汉逊酵母属(Hanseniaspora)。

表2　T8菌体形态及生理生化鉴定结果

注:“+”代表阳性,“-”代表阴性。

2.2.2菌株分子生物学鉴定对筛出菌株进行ITS基因序列分析,提取其DNA,进行PCR扩增,扩增产物经电泳检测,电泳结果如图1所示。

图1　T8菌株的电泳图Fig.1　Electrophoregram of strain T8注:“1”代表T8菌株ITS基因,“2”代表Marker。

T8菌株DNA经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳,在约750 bp 的位置出现了清晰的条带。将纯化后的 PCR 产物切胶回收委托甘肃金博研生物科技有限公司进行ITS测序,结果显示该条带大小为689 bp(GenBank accession number KT802750),提交NCBI数据库进行Blast序列比对(表3),与葡萄汁有孢汉逊酵母菌(Hanseniasporauvarum)同源性为99%。

2.3H.UvarumT8产乙偶姻发酵培养基优化

2.3.1不同碳源对H.UvarumT8发酵产乙偶姻的影响碳源不仅要满足微生物生长繁殖的需求,还要有益于代谢产物的生成,因此选择合适的碳源对微生物的生长和产物合成至关重要。选择淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖四种不同碳源进行实验,结果如图2所示。

由图2可看出,H.uvarumT8均可利用淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖发酵生产乙偶姻,以葡萄糖作为碳源时,乙偶姻产量最高,可达到12.090 g/L,并且葡萄糖的来源广泛,价格相对便宜,因此选择葡萄糖为产乙偶姻H.uvarumT8发酵培养基的最佳碳源。

2.3.2碳源最佳浓度葡萄糖是微生物生长和代谢产乙偶姻可利用的直接碳源,但发酵体系中葡萄糖浓度过高或过低,都不利于菌体的生长和代谢,因此需要研究葡萄糖浓度对菌体生长和乙偶姻含量的影响,结果如图3所示。

图2　不同碳源对乙偶姻发酵的影响Fig.2　The effect of different carbon sources on acetoin fermentation注:不同小写字母表示差异显著(p<0.05),下同。

图3　不同浓度葡萄糖对乙偶姻发酵的影响Fig.3　The effect of initial glucose concentration on acetoin fermentation

由图3可以看出,随着发酵液中葡萄糖浓度的增加,发酵结束时发酵体系中残糖含量逐渐增加,生物量和乙偶姻含量均呈现一个先上升后下降的趋势,发酵液中葡萄糖初始浓度为60 g/L时,乙偶姻含量达到最大。发酵液中初始葡萄糖浓度高于80 g/L时,生物量含量也开始下降,说明高浓度的葡萄糖对微生物生长有抑制作用,不利于发酵液中乙偶姻的积累,因此选择60 g/L为最佳初始葡萄糖浓度。

2.3.3不同氮源对H.UvarumT8发酵产乙偶姻的影响本实验选择玉米浆、蛋白胨、酵母膏、硫酸铵、硝酸铵为单一氮源,研究不同氮源对乙偶姻发酵的影响,结果如图4所示。

图4　不同氮源对乙偶姻发酵的影响Fig.4　The effect of different nitrogen sources on acetoin fermentation

从图4可以看出,以酵母膏和蛋白胨为单一氮源时,发酵液中乙偶姻含量较高,且二者之间无显著差异,说明蛋白胨和酵母膏对H.uvarumT8产乙偶姻均有显著影响。与无机氮源相比,有机氮源更有利于菌体生长和乙偶姻的生成。为了探索最佳氮源组成,有必要进一步研究蛋白胨和酵母膏的复合比例对H.uvarumT8产乙偶姻的影响。

2.3.4复合有机氮源的最佳比例通过调整发酵培养基中酵母膏和蛋白胨的添加量,研究不同氮源添加比例对乙偶姻发酵的影响,实验结果如图5所示。

图5　不同氮源添加比例对乙偶姻发酵的影响Fig.5　The effect of different nitrogen sources concentration on acetoin fermentation

由图5可以看出,发酵培养基中酵母膏和蛋白胨添加量不同,发酵结束时体系中生物量和乙偶姻含量也有所差异,随着酵母膏与蛋白胨比例的增加,生物量和乙偶姻含量均呈现一个先上升后下降的过程,酵母膏:蛋白胨为1∶1时,发酵液中生物量和乙偶姻含量均达到最大,分别为7.34 g/L和14.10 g/L。为了使发酵过程中乙偶姻更好地积累,选择发酵培养基中酵母膏、蛋白胨浓度均为10 g/L。

2.3.5(NH4)2HPO4对H.UvarumT8发酵产乙偶姻的影响(NH4)2HPO4不仅可以作为氮源被微生物代谢利用,而且(NH4)2HPO4作为一种缓冲溶液,可以对发酵体系的pH起到调节作用[18-19]。本实验通过配制不同浓度的(NH4)2HPO4发酵培养基,研究(NH4)2HPO4添加量对H.uvarumT8产乙偶姻发酵的影响,实验结果如图6所示。

图6　不同浓度的(NH4)2HPO4对乙偶姻发酵的影响Fig.6　The effect of(NH4)2HPO4 concentration on acetoin fermentation

从图6可知,随着(NH4)2HPO4浓度的增大,生物量趋于稳定,乙偶姻含量呈先增加后下降的趋势,(NH4)2HPO4浓度为8 g/L时,发酵液中乙偶姻的含量达到最大。此外,随着(NH4)2HPO4浓度的增大,发酵液pH呈先下降,后逐渐趋于平缓的趋势,(NH4)2HPO4浓度为8 g/L时,发酵液的最终pH为6.24,乙偶姻积累量最大,这是由于(NH4)2HPO4作为一种磷酸盐缓冲液,可有效调节发酵液的pH,培养液中pH为中性偏酸时,有利于酵母菌生长,进而促进发酵液中乙偶姻的积累。

2.3.6金属离子对H.UvarumT8发酵产乙偶姻的影响在微生物生长及代谢过程中,金属离子除了构成细胞成分外,K+作为一种生理调节物质,参与维持渗透压以及氧化还原电位的平衡,pH稳定等;Mg2+、Mn2+是酶的激活剂,能够控制许多酶类参与的化学反应的进行[12]。根据表1所列因素和水平,以发酵结束时发酵液中乙偶姻的含量为指标,采用L9(34)正交表对发酵培养基中不同金属盐浓度进行优化,正交设计结果和方差分析结果如表4和表5所示。

表4　正交实验设计及结果

表5　正交实验设计方差分析结果

注:“*”表示差异显著(p<0.05)。

从表4正交结果可知,处理3(A1B3C3)乙偶姻含量最高。前期研究已证实了酵母菌发酵产乙偶姻的代谢途径为:酵母菌通过糖酵解生成丙酮酸,丙酮酸在丙酮酸脱氢酶作用下生成乙酰-TPP,乙酰-TPP与乙醛在醛连接酶的作用下生成乙偶姻[20]。由方差分析(表5)可知,MgSO4·7H2O添加量对发酵液中乙偶姻含量有显著影响,主要是由于Mg2+是PDP的主要辅助因子,而PDP和PDK共同控制丙酮酸脱氢酶的活性,进而影响发酵液中乙偶姻的含量[21-22]。通过极差分析,三种金属盐对乙偶姻发酵影响的主次因素为B>A>C,极差分析获得的最佳实验组合为A1B3C3,不需要做验证实验。因此确定培养基中无机盐的添加量为KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.75 g/L,MnSO40.6 g/L。

2.4接种T8菌株的食醋酿造验证实验

按照凉州熏醋酿造工艺流程进行食醋模拟发酵实验,在酒精发酵阶段人工接种5%(v/m)酿酒酵母菌和T8种子液,醋酸发酵结束后采用GC-MS法测定发酵产物中四甲基吡嗪的含量,以酒精发酵阶段不接种T8菌株为对照,实验结果如表6所示。从表6可以看出,接入T8菌株后,料醅中四甲基吡嗪的含量与对照相比提高了22.1%,说明T8菌株在食醋酿造过程中有明显的增香作用。

表6　接种T8菌株食醋中四甲基吡嗪的含量

3　结论

本实验对筛选获得的产乙偶姻酵母菌T8进行了生理生化鉴定和分子生物学鉴定,确定其为葡萄汁有孢汉逊酵母(H.uvarum),可为食醋及相关发酵食品风味改善提供菌种来源。优化的H.uvarumT8菌株发酵产乙偶姻种子培养液为:葡萄糖60 g/L,蛋白胨和酵母膏复合氮源各为10 g/L,(NH4)2HPO4浓度为8 g/L,培养基的无机盐组分是KH2SO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.75 g/L、MnSO40.6 g/L。培养基组分优化后,生物量为7.68 g/L,乙偶姻含量到达15.236 g/L,与初始发酵培养基乙偶姻产量12.090 g/L相比提高了20.65%。人工接种T8菌株种子液的食醋酿造实验结果表明,所酿食醋中特征风味物质——四甲基吡嗪的含量较对照提高了22.1%,增香效果明显,证明H.UvarumT8菌株可以作为食醋酿造的增香酵母。

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Isolation of yeast with high acetoin-producing ability from Liangzhou fumigated vinegar and optimization for its fermentation medium

ZHAO Feng-qin,YUN Jian-min*,ZHAO Xiao-rui,LI Hong-zhen,JIA Ya-li

(College of Food science and engineering of Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Acetoin,a precursor of tetramethylpyrazine,is identified as a flavor component of Liangzhou fumigated vinegar. In the test,an acetoin-producing strain T8 was isolated from the fermented cultures of Liangzhou fumigated vinegar,which was identified asHanseniasporauvarumby classical identification methods and ITS gene sequence similarities. In order to further know the nutritional requirements of T8 growth and metabolism,the fermentation medium for producing acetoin with T8 was optimized,so that it could provide the better seed medium for flavoring yeast in modern vinegar brewing process.The key fermentation factors of affecting acetoin yield byH.uvarumwere studied,including the carbon resource,the nitrogen resource,inorganic salts concentration. The results showed that the best fermentation medium component was:glucose 60 g/L,peptone 10 g/L,yeast extract 10 g/L,(NH4)2HPO48 g/L,KH2PO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.75 g/L,MnSO40.6 g/L. Under the optimized conditions,the acetoin yield reached 15.236 g/L,which was increased by 20.65% in comparison with the initial fermentation medium,and the content of tetramethylpyrazine in vinegar cultures was increased by 22.1% in comparison with control in the artificial inoculation vinegar brewing test,it showed that T8 could help to improve the vinegar flavor.

vinegar brewing;acetoin;yeast;fermentation medium;optimization

2015-12-16

赵风琴(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：zhaofq0825@126.com。

贠建民(1968-)，男，博士，教授，研究方向：食品微生物发酵与发酵工程，E-mail：yunjianmin@gsau.edu.cn。

国家自然科学基金资助项目(31360405)。

TS264.2

A

1002-0306(2016)11-0147-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.022