长沙地区产金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌的分子流行病学特征

邬靖敏，邹明祥，李　军

(1 长沙市第一医院，湖南 长沙　410005； 2 中南大学湘雅医院，湖南 长沙　410008)



·论著·

长沙地区产金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌的分子流行病学特征

邬靖敏1，邹明祥2，李军2

(1 长沙市第一医院，湖南 长沙410005； 2 中南大学湘雅医院，湖南 长沙410008)

目的了解长沙地区多重耐药铜绿假单胞菌(PA)产金属β-内酰胺酶(MBL)菌株基因型和流行情况。方法收集该地区7所综合医院临床分离的PA，对菌株进行鉴定和药敏试验，采用EDTA协同试验、E-test MBL进行MBL表型筛选，聚合酶连反应(PCR)明确其基因型，肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应(ERIC-PCR)进行同源性分析。结果经EDTA协同和E-test MBL初步筛查，81株PA中仅10株为强阳性；PCR结果显示，18株 PA MBL基因阳性，其中IMP-9型11株，IMP-1型1株和VIM-2型6株，未检测出SIM、SPM、GIM和NDM-1基因型。ERIC-PCR分型结果显示，12株产IMP PA存在多个型别，而6株产VIM-2菌株为同一型别。结论长沙地区多重耐药PA以IMP-9和VIM-2基因型最常见。

铜绿假单胞菌； 金属β-内酰胺酶； 金属酶； 基因型； 肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应

[Chin J Infect Control，2016，15(7)：447-451]

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)是一种常见的引起医院获得性感染的条件致病菌。金属β-内酰胺酶(metallo-β-lactamase，MBL)，简称金属酶，是致使PA对碳青霉烯类抗生素耐药的重要机制之一。产MBL PA检出日益增加[1]，泛耐药PA的出现[2]，以及有效酶抑制剂的缺乏[3]，给临床抗感染治疗和医院感染防控带来极大困难。本研究拟对长沙地区7所综合医院81株多重耐药PA进行MBL基因检测，并对产IMP/VIM-2酶菌株进行同源性分析，现将结果报告如下。

1　材料与方法

1.1菌株与来源收集2011年1—6月长沙地区7所综合性医院临床分离的非重复多重耐药PA 81株，其中中南大学湘雅医院46株，中南大学湘雅三医院14株，浏阳市人民医院7株，长沙市第三医院6株，湖南省第二人民医院4株，长沙市第一医院3株，湖南省人民医院1株。标本类型有痰、支气管分泌物、咽拭子、创面分泌物、血、尿、导管尖端和引流液等。多重耐药菌PA的判断标准参照李春辉等[4]翻译的文献。产IMP和 VIM-2阳性对照菌株为临床分离菌株，已通过测序证实。铜绿假单胞菌ATCC 27853购自卫生部临床检验中心。

1.2试剂与仪器VITEK-2 GN鉴定板和E-test MBL购自法国生物梅里埃公司。亚胺培南药敏纸片和M-H培养基干粉购自英国OXOID公司，0.5 mol/L EDTA溶液为自行配制，聚合酶链反应(PCR)试剂购自美国OMEGA，D2000 Marker购自天根生化科技，所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3MBL表型筛选

1.3.1EDTA协同试验将0.5麦氏单位待测菌液涂布于MH平板，静置10 min，待干燥后在平板中间贴亚胺培南药敏纸片(10 μg/片)和EDTA纸片(0.5 moL/L EDTA溶液 4 μL)，纸片边缘相距10～15 mm。35℃过夜培养后，若靠近亚胺培南药敏纸片处出现抑菌圈扩大或“匙孔现象”则为阳性。

1.3.2E-test MBL试验在涂有0.5麦氏单位菌液的MH平板上贴商品化E-test条，该E-test条两端分别为亚胺培南(4～256 μg/mL) 和亚胺培南(1～64 μg/mL)+EDTA(320 μg/mL)。35℃过夜培养后，若IP/IPI的MIC比值≥8倍则为阳性。

1.4DNA提取及MBL基因PCR采用煮沸法提取DNA。35℃过夜培养，挑取单个待测菌落置于盛有300 μL无菌双蒸水的EP管中，95℃煮10 min并置冰上快速冷却，13 000 r/min低温离心10 min，上清则为细菌DNA模板，分装并于-20℃保存备用。MBL基因PCR：根据参考文献[5-6]设计引物，并用Primer premier 5.0软件验证引物。引物序列见下表1。PCR反应体系为25 μL,即2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板2 μL，无菌蒸馏水8.5 μL。PCR反应条件：预变性94℃ 2 min；变性94℃ 1 min，退火72℃ 1 min，共30个循环；最后72℃再延伸5 min。取5 μL扩增产物进行1.5%琼脂糖电泳，条件为100 V 40 min。PCR产物测序由北京六合华大基因有限公司完成，将测序结果在GenBank上进行BLAST比对分析。

1.5菌株同源性分析采用肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应(enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction，ERIC-PCR)分别对产IMP和VIM-2 PA进行同源性分析。引物序列为ERIC-2：5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’。判定标准为：主要的条带位置和数量相同则是同一基因型[7]。PCR反应体系是2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，引物1 μL，DNA模板2 μL，无菌蒸馏水补足至25 μL。PCR反应条件是95℃预变性5 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 45 s，共30个循环；最后72℃再延伸3 min。取5 μL PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，100 V电泳40 min。紫外灯下观察结果，并用凝胶成像系统进行拍照。

2　结果

2.1MBL表型初筛经EDTA协同和E-test MBL初步筛查，81株PA中仅10株为强阳性，见图1～2。

图1 　EDTA协同试验检测结果

图2 　E-test MBL试验检测结果

2.2MBL基因确证全部菌株提取DNA直接进行MBL基因扩增，结果显示，18株PA扩增出明显条带。经产物测序及BLAST比对，其中IMP-9型11株，IMP-1型1株和VIM-2型6株。未检测到SIM-1、SPM-1、GIM和NDM-1基因阳性的PA。见图3。

A:IMP基因；B:VIM-2基因；M：D2000 DNA Marker；1：阳性对照；2：铜绿假单胞菌ATCC 27853；3—5：PCR扩增阳性的临床样本

图3IMP和VIM-2基因扩增产物电泳图

Figure 3Electrophoresis map of PCR amplification products ofIMPandVIM-2 genes

2.3表型检测与基因确证相符性EDTA协同试验MBL表型阳性的10株PA均扩增到MBL基因，而12株产IMP PA中4株表型初筛阴性，6株产VIM-2 PA 4株表型初筛阴性。

2.4产IMP和VIM-2型MBL PA的标本来源产MBL PA菌株分布于长沙地区多所医院，主要分离于重症监护病房(ICU)和烧伤科。详见表2。

表2　产IMP和VIM-2型MBL PA来源

X1：中南大学湘雅医院；X3：中南大学湘雅三医院；SR：湖南省人民医院；SY：长沙市第一医院；SS：长沙市第三医院

2.5产酶菌株ERIC-PCR分型12株产IMP PA为多个克隆型，呈现5种型别。其中3、11、13、14、15和 SY7为A型，36 和T26为B型，T15和843为C型，35为D型，T40为E型，片段大小为250～2 000 bp，见图4。而6株产VIM-2铜绿假单胞菌为同一克隆型。见图5。

M：D2000 DNA Marker；1—12泳道依次为3、11、13、14、15、35、36、T15、T26、T40、843、SY7号菌株

M：D2000 DNA Marker；1—6泳道依次为23、31、37、38、39、T27号菌株

图5 产VIM-2 PA的ERIC-PCR电泳图

Figure 5ERIC-PCR electrophoresis map of VIM-2-producingP.aeruginosa

3　讨论

近年来，PA对以亚胺培南为代表的碳青霉烯类抗生素的耐药率逐年上升，甚至出现泛耐药菌株，成为临床棘手的难题。由于细菌存在地域和医院间差异，准确地掌握长沙地区PA产酶菌株的分子流行病学特征对临床治疗和感染控制具有重要的意义。

本组研究结果显示，长沙地区产MBL PA菌株以IMP-9和VIM-2基因型为主，与李俏俏[8]报道的台州地区的基因型相近。产酶菌株分布于长沙地区多所医院，主要分离于ICU和烧伤科，这可能与患者年龄大、长期卧床、接受机械通气、留置中心静脉管、导尿管等侵袭性操作有关[9]。E-test MBL试验基于EDTA可螯合Zn2+导致MBL失活原理，采用此方法进行MBL表型筛选时，若IP侧MIC≤4 μg/mL则无法检测出具体的MIC值，不适用于检测亚胺培南中介或敏感的菌株，且E-test MBL试纸条较为昂贵，相比之下，EDTA协同试验是筛选MBL较为简单经济的方法。本研究未检测到产NDM-1 PA，而国际上已开始有此类菌株的报道[10]。

本研究采用ERIC-PCR进行菌株同源性分析，原因是其具有操作简单、成本低、分辨效果好、可重复性较好等优点，也常用于临床实验室分子流行病学初步监测；而脉冲场凝胶电泳方法操作复杂、周期长、耗费高，而且还需配备专门的仪器。ERIC-PCR结果显示，12株产IMP PA为多个克隆型，散在分布于多个医院不同病区，以痰标本来源为主(占75%，9/12)。医护人员在诊治过程中需高度重视，加强手卫生，防止耐药菌株播散[11]。6株产VIM-2 PA为同一克隆型，有4株分离自中南大学湘雅医院，其中2株来自烧伤科，另外2株分别来自于中南大学湘雅三医院烧伤科、长沙市第一医院ICU。各医院尤其是ICU和烧伤科医生需高度警惕呼吸道和创面多重耐药PA感染[12]，感染控制部门应加强早期监测，督促临床科室早期隔离相关病例，防止多重耐药PA的暴发流行。

综上所述，长沙地区产MBL PA的分离情况不容乐观，各医院需加强此类菌株的耐药监测和实施医院感染控制措施。本研究不足之处为菌株主要来源于中南大学湘雅医院，其他医院菌株收集较少，菌株代表性不足。

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(本文编辑：周鹏程)

Molecular epidemiological characteristics of metallo-β-lactamase-producingPseudomonasaeruginosafrom Changsha

WUJing-min1,ZOUMing-xiang2,LIJun2

(1TheFirstHospitalofChangsha,Changsha410005,China; 2XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410008,China)

ObjectiveTo investigate the genotypes and epidemic of metallo-β-lactamase-(MBL)-producingPseudomonasaeruginosa(P.aeruginosa) in Changsha. MethodsP.aeruginosaisolated from seven comprehensive hospitals in Changsha were collected and performed identification and antimicrobial susceptibility testing, phenotypes of MBL were detected with EDTA-disk synergy test and E-test, genotypes were determined by polymerase chain reaction (PCR), homology analysis were conducted by enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR (ERIC-PCR). ResultsPreliminary screening by EDTA-disk synergy test and E-test showed that only 10 of 81 isolates were strong positive; PCR result showed that 18 isolates were positive for MBL, 11 of which wereIMP-9-type MBL, 1 wasIMP-1-type,and 6 wereVIM-2-type.SIM,SPM,GIM, andNDM-1-types were not found. ERIC-PCR showed that 12 strains of IMP-producingP.aeruginosahas multiple types, 6 VIM-2-producing strains were of the same type. ConclusionIMP-9 andVIM-2 are main genotypes inP.aeruginosain Changsha．

Pseudomonasaeruginosa; metallo-β-lactamase; metalloenzyme; genotype; enterobacterial repetitive intergenic consensus-polymerase chain reaction

2016-04-11

湖南省发改委(湘发改高技[2012]1493号；湘发改投资[2014]658号)；湖南省自然科学基金(14JJ7003)

邬靖敏(1987-)，女(汉族)，江西省宜春市人，检验技师，主要从事细菌耐药机制研究。

邹明祥E-mail：zoumingxiang@126.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.07.002

R181.3+2R378.99+1

A

1671-9638(2016)07-0447-05