雷帕霉素对帕金森病小鼠神经保护效应的研究*

瞿　奇，何小亮，张云龙，王　坤，张秀萍（1.广州市第六中学，广东510300；.南方医科大学基础医学院免疫学教研室，广东广州510515；3.南方医科大学基础医学院实验教学管理中心，广东广州510515）

·论著·

雷帕霉素对帕金森病小鼠神经保护效应的研究*

瞿奇1#，何小亮2#，张云龙2，王坤1△，张秀萍3△
（1.广州市第六中学，广东510300；2.南方医科大学基础医学院免疫学教研室，广东广州510515；3.南方医科大学基础医学院实验教学管理中心，广东广州510515）

目的研究雷帕霉素对帕金森病（PD）小鼠模型的神经保护效应。方法采用悬挂试验和爬杆试验检测雷帕霉素对PD小鼠运动行为障碍的改善作用，免疫组织化学检测雷帕霉素对PD小鼠黑质酪氨酸羟化酶、α-突触核蛋白表达水平的影响。结果雷帕霉素明显改善了PD小鼠运动行为缺陷，提高了酪氨酸羟化酶的表达，降低了α-突触核蛋白的表达。结论雷帕霉素对PD小鼠具有明显的神经保护效应。

帕金森病；多巴胺；神经元；突触蛋白类；西罗莫司

帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是一种中老年常见神经系统变性疾病，临床症状主要以静止性震颤、运动迟缓、肌张力增高和姿势平衡障碍为主，目前，PD病因仍不甚明确。寻找针对PD新的治疗靶点和有效药物对改善PD患者生活质量具有重要意义。雷帕霉素（西罗莫司）是从链球菌中提取的大环内酯类药物，具有免疫抑制作用。有研究表明，雷帕霉素可促进阿尔兹海默病模型中淀粉样蛋白的清除，显示了该药具有明显的神经保护效应［1-5］。雷帕霉素是否可改善PD小鼠运动行为障碍及提高酪氨酸羟化酶的表达，从而对黑质多巴胺神经元发挥神经保护效应是本研究的关键所在。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物24只雄性C57BL小鼠购自广东省医学实验动物中心。

1.1.2主要试剂1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）购自美国Sigma-Aldrich公司，抗酪氨酸抗体购自美国Millipore公司，α-突触核蛋白购自美国Santa Cruz生物技术有限公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠和羊抗兔二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.3主要仪器冰冻切片机（德国Leica公司）、倒置显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）等。

1.2方法

1.2.1PD模型制备及雷帕霉素治疗参照文献［6-7］的方法腹腔注射MPTP制备PD小鼠模型，同时应用雷帕霉素进行治疗。将24只（每只体质量25 g）C57BL小鼠分为治疗组、对照组、雷帕霉素组和PD组，每组6只。治疗组注射 MPTP及雷帕霉素，给药方法：注射MPTP前2 d（第1～2天）注射雷帕霉素5 mg/（kg·d），每天1次，共2 d；然后同时给予MPTP、雷帕霉素5 d（第3～7天），上午9：00注射MPTP 30 mg/kg，晚上21：00注射雷帕霉素5 mg/（kg·d）；注射MPTP 5 d后继续单独注射雷帕霉素5mg/（kg·d）4 d（第8～11天），每天1次。对照组第1～2天及第8～11天注射生理盐水0.1 mL/10 g，每天1次，第3～7天上午9：00和晚上21：00注射生理盐水0.1 mL/10 g，各1次。雷帕霉素组：第1～2天及第8～11天每天注射雷帕霉素1次（剂量与治疗组相同），第3～7天上午9：00注射生理盐水（剂量与对照组相同），晚上21：00注射雷帕霉素。PD组：第1～2天及第8～11天每天注射生理盐水1次（剂量与对照组相同），第3～7天上午9：00注射MPTP（剂量与治疗组相同），晚上21：00注射生理盐水。末次注射1 d后于大脑不同部位取材进行相关指标检测。

1.2.2行为学试验

1.2.2.1爬杆试验将一直径为2 cm的泡沫塑料小球固定于一根长50 cm、粗1 cm的木杆顶端，木杆上缠2层纱布以防打滑。持小鼠尾部将其头向下置于竿顶（以小鼠双后肢置于球上为准），让其自然爬下，小鼠自站于竿顶至双前肢接触竿底平台为爬完全长。在造模后各组分别取一定数量小鼠进行爬杆试验，观察小鼠行为学改变，记录爬竿时间。

1.2.2.2悬挂试验自制有机玻璃试验箱，水平放置的金属杆直径1.5 mm，距地面30 cm，金属杆上方1 cm加盖，以避免小鼠翻坐于金属杆上，试验中小鼠悬挂于金属杆上，记录落地前时间。每次检测间隔时间为1 min，共检测5次，取平均值。

1.2.3免疫组织化学（免疫组化）染色将小鼠深度麻醉后快速取脑，固定过夜。-25℃用冰冻切片机切成10 μm厚脑片，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）漂洗3次，每次5 min，封闭液（PBS、0.1%聚乙二醇辛基苯基醚、5%牛血清清蛋白）室温孵育15 min后加入一抗。一抗4℃孵育过夜，PBS漂洗3次，每次5 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育2 h，二氨基联苯氨染色，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，封片观察。

1.3统计学处理应用SPSS11.0统计软件进行数据分析，计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析（One Way ANOVA）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1四组小鼠悬挂试验、爬杆试验结果比较PD组小鼠出现立毛、震颤等症状，治疗组小鼠运动行为缺陷明显改善，悬挂时间明显延长（图1A），爬到杆底所用时间明显缩短（图1B），与PD组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05或0.01）。

图1　四组小鼠悬挂试验、爬杆试验结果比较

2.2四组小鼠脑组织酪氨酸羟化酶表达水平比较治疗组小鼠脑组织酪氨酸羟化酶表达水平较PD组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。

图2　四组小鼠脑组织酪氨酸羟化酶表达水平比较（免疫组化，50×）

2.3四组小鼠脑组织α-突触核蛋白表达水平比较治疗组小鼠脑组织α-突触核蛋白表达水平较PD组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），见图3。

图3　四组小鼠脑组织α-突触核蛋白表达水平比较（免疫组化，400×）

3　讨　论

PD是仅次于阿尔兹海默病的中老年常见神经系统变性疾病，据流行病学资料显示，我国目前PD患者约200万，约占世界PD患者总数的2/5，我国每年新增PD患者近10万人，65岁以上人群患病率为1.67%［8］。随着我国人口老龄化的到来，PD发病率逐年递增，加之该病起病缓慢，病程较长，晚期常出现肢体僵硬，同时伴高级神经系统功能障碍，如痴呆、抑郁等，甚至丧失生活自理能力，严重影响患者身心健康，给社会和患者家庭带来沉重负担。根据PD发病机制，延缓黑质多巴胺能神经元变性和补充多巴胺是治疗PD的基本原则，基于此，目前，左旋多巴仍然是治疗PD的“金标准”，其可通过血脑屏障，在多巴胺脱羧酶作用下变为多巴胺，发挥替代疗法的作用。在疾病初期具有明显缓解作用，但长期服用易出现直立性低血压、心律失常，且易出现谵妄、幻觉等精神症状，严重时出现异动症、剂末恶化现象、“开-关”现象等并发症［9］。颅内手术，如苍白球切开术及下丘脑电刺激能减轻一些PD症状，神经干细胞移植可通过细胞增殖、分化与整合替代多巴胺神经元［10-12］。然而上述治疗方法无一能改变黑质纹状体神经变性的进程，因而加强PD的病因学研究、发现研制PD治疗新药的有效靶标对提高人类健康水平具有重大意义。

雷帕霉素通过抑制雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路调节机体自噬、新陈代谢等。有研究表明，雷帕霉素通过有效抑制白介素-2对T、B淋巴细胞的激活，使细胞停滞在G1期，有效减轻炎性反应［13］。哺乳动物mTOR通路广泛存在于机体细胞质内，主要功能是依据细胞营养状态调节细胞增殖及分化，且对细胞自噬、新陈代谢及核糖体形成等均具有调控作用［14-16］。因此，雷帕霉素可通过多种途径发挥调节作用。近来年有研究发现，雷帕霉素能延长小鼠寿命，且阿尔兹海默病动物模型的研究结果表明，雷帕霉素能改善阿尔兹海默病小鼠的认知，减少淀粉蛋白的聚集，从而发挥神经保护作用［1-5］。本研究对雷帕霉素在PD中的神经保护效应进行了探讨，结果显示，注射雷帕霉素后能明显改善注射MPTP导致的小鼠立毛、震颤等表现，同时通过行为学试验发现，雷帕霉素能延长PD小鼠悬挂时间，缩短PD小鼠爬杆时间，说明雷帕霉素能明显改善PD小鼠运动行为障碍（图1）。

多巴胺神经元凋亡是PD主要的发病机制，Malagelada等［17］提出，雷帕霉素可通过下游真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1及丝氨酸/苏氨酸激酶通路抑制低氧诱导因子1反应基因蛋白的翻译，同时通过促进蛋白激酶B第308位点上的苏氨酸残基磷酸化，减少神经元凋亡。本研究通过采用免疫组化检测小鼠脑组织酪氨酸羟化酶的表达，结果发现，雷帕霉素能提高中脑黑质酪氨酸羟化酶的表达，从而对多巴胺神经元发挥神经保护效应。作者推测，雷帕霉素可能通过mTOR通路，促进与细胞生存密切相关的蛋白激酶B通路的激活，进而对多巴胺神经元发挥保护效应（图2）。

PD的主要病理改变是α-突触核蛋白的聚集，本研究发现，雷帕霉素能明显降低中脑黑质突触核蛋白的聚集（图3）。有研究表明，雷帕霉素通过直接抑制其下游信号通路mTORC1的功能，促进细胞自噬功能，减轻氧自由基的损伤［18-19］。作者推测，雷帕霉素在PD中可能通过促进细胞自噬功能，加强细胞对突触核蛋白的清除，从而减轻突触核蛋白对神经元的毒性作用，进而发挥神经保护效应。关于雷帕霉素对PD小鼠发挥神经保护效应的机制尚有待于进一步研究。

综上所述，本研究发现，雷帕霉素明显改善了PD小鼠运动行为缺陷，提高了PD小鼠酪氨酸羟化酶的表达，降低了PD小鼠α-突触核蛋白的表达，表明雷帕霉素对PD小鼠具有明显神经保护效应，可能成为治疗PD的一种新型药物。

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Research on neuroprotective effects of rapamycin in Parkinson′s disease mice*

Qu Qi1#，He Xiaoliang2#，Zhang Yunlong2，Wang Kun1△，Zhang Xiuping3△（1.Guangzhou Municipal No.6 Middle School，Guangzhou，Guangdong 510300，China；2.Teaching and Researching Section of Immunology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong 510515，China；3.Teaching Center of Experimental Teaching Management，School of Basic Medical Sciences，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong 510515，China）

ObjectiveTo study the neuroprotective effects of rapamycin in Parkinson′s disease（PD）mice.MethodsThe suspension test and the pole-climbing test were adopted to detect the improvement effect of rapamycin on the movement disorder of PD mice.The expression of tyrosine hydroxylase and α-synuclein in the substantia nigra of PD mice were examined via immunohistochemistry.ResultsRapamycin significantly improved the movement disorder of PD mice，increased the expression of tyrosine hydroxylase and decreased the expression of α-synuclein in the PD mice.ConclusionRapamycin has the obvious neuroprotective effects in PD mice.

Parkinson disease；Dopamine；Neurons；Synapsins；Sirolimus

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.06.001

A

1009-5519（2016）06-0801-03

广东省科技计划项目（2013B021800305）；广州市科技计划项目（2014J4100008）。

瞿奇（1997-），在读高中生，主要从事帕金森动物模型制备及动物行为学实验研究；何小亮（1987-），在读硕士研究生，主要从事免疫组织化学实验研究。

#共同第一作者。

△张秀萍，E-mail：spz9528@163.com；王坤，E-mail：281146423@qq.com。

（2016-01-26）