长期烟雾暴露对大鼠肺血管重塑及转化生长因子-β1表达的影响*

彭红星， 杨荣时， 王 焕， 曾玉兰

(华中科技大学同济医学院附属梨园医院呼吸内科，湖北武汉430077)

长期烟雾暴露对大鼠肺血管重塑及转化生长因子-β1表达的影响*

彭红星， 杨荣时， 王 焕， 曾玉兰△

(华中科技大学同济医学院附属梨园医院呼吸内科，湖北武汉430077)

目的:观察长期吸烟对大鼠肺血管重塑及转化生长因子-β1(TGF-β1)的影响，探讨其发生的可能机制。方法:将36只健康SD雄性大鼠随机分为对照组、烟雾暴露2周(S-2W)和烟雾暴露12周(S-12W)组。苏木精-伊红染色和α-平滑肌肌动蛋白染色切片观察肺血管重塑的程度，免疫组化法检测增殖细胞核抗原(PCNA)和TGF-β1在肺动脉的相对表达;RT-qPCR检测肺动脉TGF-β1的mRNA表达。结果:随烟雾暴露时间延长，模型组血管壁厚度和血管直径比值(WT%)和完全肌化血管比例均较对照组明显增大，差异具有统计学显著性(P＜0.01)。模型组的PCNA及TGF-β1蛋白表达水平均较对照组增大，且两模型组之间差异有统计学显著性(P＜0.01)。与对照组比较，模型组TGF-β1的mRNA表达均显著增加(P＜0.05)，其中S-2W组和S-12W组之间的差异亦有统计学显著性(P＜0.05)。TGF-β1的mRNA表达与WT%和完全肌化血管比例呈显著正相关(P＜0.01); TGF-β1的mRNA表达与PCNA蛋白表达呈显著正相关(P＜0.01)。结论:长期烟雾暴露可导致大鼠肺血管重塑的形成，其机制可能与吸烟上调大鼠肺血管TGF-β1的mRNA表达，诱导肺血管平滑肌细胞增殖有关。

烟雾;肺血管重塑;转化生长因子-β1;平滑肌

吸烟和二手烟暴露与慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘等呼吸系统疾病的发病密切相关，烟雾暴露不仅可引起肺部的异常炎症反应，还可促使气道平滑肌显著增殖，使肌型动脉和内膜面积百分比显著增加，降低管腔面积百分比，进而使肺小动脉发生重构，导致肺动脉高压的形成［1］。转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1，TGF-β1)是调节细胞分化增殖的多功能生长因子，可促进细胞外基质的生成及激活血管外膜成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，并向肺血管中膜层迁移造成中膜层增厚，导致肺血管重塑，有研究表明吸烟可增加肺组织及支气管上皮细胞的TGF-β1表达水平［2］。本研究通过观察长期烟雾暴露对大鼠肺血管平滑肌增殖及TGF-β1的影响，探讨肺血管重塑形成的可能发生机制。

材料和方法

1 实验动物和试剂

武汉卷烟厂产红金龙香烟，每支含尼古丁1.0 mg和焦油15 mg，烟气中一氧化碳含量15 mg;小鼠抗增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)单克隆抗体、小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin，α-SMA)单克隆抗体和SABC免疫组化试剂盒均购自武汉谷歌生物工程有限公司; TRIzol购自Ambion;M-MLV逆转录酶试剂盒SYBR Green Mix试剂盒均购自Invitrogen。TGF-β1β-actin引物根据Primer Premier 5软件设计，由武汉谷歌生物公司合成。

2 方法

2.1 动物分组及烟雾暴露模型的建立 SD大鼠随机分为对照(control)组、烟雾暴露 2周(2-week smoke exposure，S-2W)组和烟雾暴露12周(S-12W)组，每组12只。模型组SD大鼠放入60 cm×57 cm ×100 cm的烟熏箱里，使模型组大鼠被动吸烟。每次点燃2支香烟放入，燃烧10 min，休息5 min后再放入2支香烟，上、下午各吸烟20支，中间间隔时间不少于4 h，每周吸烟6 d。用CY-100B数字测氧仪监测烟熏箱中的氧浓度，根据监测结果开放通气孔的数目，使烟熏箱中的氧浓度保持20%～21%。正常对照组大鼠饲养在无烟环境下。

2.2 样品留取 到达干预时点后，用10%的水合氯醛麻醉，放血处死大鼠。分离出肺脏，取左肺用4%多聚甲醛固定，二甲苯透明，行石蜡包埋，病理切片机切片，切片厚约4 μm。自右肺仔细分离出肺动脉，于－80℃冰箱保存，便于后期RT-qPCR用。

2.3 肺组织病理学观察和图像分析 石蜡切片常规做HE染色，观察支气管-肺组织病理学变化，每张切片选取断面积较圆、直径为50～200 μm的5支，以图像分析系统测量记录肺血管壁厚度和血管直径的比值(WT%)。

2.4 α-SMA免疫组织化学染色检测血管肌化 石蜡切片脱蜡至水，微波炉修复抗原，一次滴加小鼠抗小鼠抗α-SMA单克隆抗体、生物素化羊抗小鼠或羊抗兔IgG和SABC试剂，DAB显色，苏木素复染。用PBS替代I抗作为阴性对照。光学显微镜下观察，阳性表达为胞浆内有细丝状棕黄色着色。将切片置于显微镜下随机观察30条血管，将组织切片之中所有直径在100 μm以下的肺小血管分为3种类型:未肌化的血管(α-SMA染色阳性长度小于周长的25%)、部分肌化的血管(α-SMA染色阳性长度为周长的25%～75%)和完全肌化的血管(α-SMA染色阳性长度大于周长的75%)。以完全肌化的血管数目占肺小血管总数的百分比来表示肺血管重构时肌化血管的程度。

2.5 免疫组织化学法检测PCNA和TGF-β1的蛋白表达 方法同上，I抗均为1∶200稀释。显微镜下观察，每张切片选取5支50～200 μm阳性染色肺小动脉，计算PCNA阳性细胞率及TGF-β1平滑肌细胞积分吸光度(IA)值。

2.6 RT-qPCR检测TGF-β1的mRNA表达 将上述实验中冻存保管的大鼠肺动脉平滑肌组织100 mg，加1 mL TRIzol试剂，按说明书提取总RNA，取1 μg按逆转录试剂盒说明逆转录为cDNA，取1 μL做PCR扩增。TGF-β1的上游引物为 5’-CTTTAGGAAGGACCTGGGTTG-3’，下游引物为5’-GGTTGTGTTGGTTGTAGAGGG-3’，扩增产物长度为140 bp;内参照 β-actin的上游引物为 5’-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3’，下游引物为 5’-TTGCTGACAATCTCTTGAGGGAG-3’，扩增产物长度为201 bp。反应在Bio-Rad IQ5荧光定量PCR仪中进行，反应条件:为95℃5 min;95℃ 15 s，60℃60 s，72℃15 s，40个循环。PCR的结果采用2－ΔΔCt法来测定目的基因的相对表达。

大发厂财大气粗，工价高得我和阿花叫苦不迭，他们的利润空间已是微乎其微。这是景花厂无论如何承受不起的。阿花说，我们只有降低物耗成本，提高工价。于是景花厂也提了工价，但与大发厂相比，工价还是低了。

3 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，计量资料均以均数±标准差(mean±SD)表示，两两比较采用t检验，多组间差异的显著性检验采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐时两组之间采用SNK检验，方差不齐时用Dunnet检验，相关分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 HE染色观察肺组织病理形态学改变

对照组肺动脉壁较薄，结构正常。模型组各组随烟雾暴露时间延长，气道和血管周围炎性细胞浸润逐渐加重，肺血管壁逐渐增厚。但未见肺泡壁变薄、断裂等肺气肿征象(图1)。烟雾暴露2周和12周组WT%值较对照组显著增加，烟雾暴露12周组肺动脉壁增厚最明显，管腔狭窄。烟雾暴露组之间差别有统计学显著性(表1)。

Figure 1.Histopathological observation of pulmonary arteries(HE staining，×200).图1 各组大鼠肺组织病理形态学改变

2 肺小动脉肌化的观察

α-SMA免疫组化染色后经统计，肺小动脉中完全肌化血管比例、部分肌化血管比例和未肌化血管比例如图2所示，对照组大鼠完全肌化血管约占3%，肺小动脉以未肌化和部分肌化血管为主。与对照组相比，烟雾暴露各组大鼠肺小动脉完全肌化血管明显增多增厚，而且未肌化血管和部分肌化血管则逐渐减少。S-12W组与S-2W组比较，差异有统计学显著性(P＜0.05)，见表1。

表1 各组大鼠肺血管重塑指标、PCNA及TGF-β1蛋白表达的比较Table 1.The pulmonary artery remodeling indexes and the protein expression of PCNA and TGF-β1 in different groups(Mean±SD.n=12)

3 免疫组化方法检测各组大鼠PCNA和TGF-β1蛋白表达

对照组肺动脉平滑肌细胞无PCNA阳性染色，S-2W肺动脉平滑肌细胞胞核PCNA呈弱阳性染色，S-12W组肺动脉平滑肌细胞胞核PCNA呈强阳性染色。结果显示，PCNA阳性细胞随肺血管重塑加重而增多，两者呈正相关，故可将其作为肺血管重塑进展的指标之一。

对照组肺动脉无TGF-β1阳性染色，S-2W肺动脉平滑肌细胞胞浆TGF-β1呈弱阳性染色，S-12W组肺动脉平滑肌细胞胞浆TGF-β1呈强阳性染色，见图2。

4 RT-qPCR检测TGF-β1的mRNA表达

对照组TGF-β1的mRNA无明显表达，烟雾暴露大鼠随烟雾暴露时间的延长，TGF-β1的mRNA水平均较正常组升高。其中S-12W组TGF-β1的mRNA表达高于S-2W组，两组间差异有统计学显著性(P＜0.05)，见图3。

讨论

香烟烟雾中含有多种气相或者颗粒状的化学物质，包括尼古丁和焦油、烟碱、一氧化碳、胺类、酚类、醛类等多种氧化剂和自由基。流行病学调查表明吸烟是患有心血管疾病、慢性肺部疾病及各类癌症的重要危险因素;与健康非吸烟者比较，“健康吸烟者”肺泡壁变薄及肺泡腔扩大，还不同程度存在血管壁增厚，管腔狭窄，内皮细胞增生。韩素霞等［3］研究表明烟雾暴露大鼠肺小动脉肌化程度增加，肺动脉血管内膜增生，管壁明显增厚，官腔狭窄。本研究结果发现，S-2W组大鼠肺小血管的肌化比例较正常对照组增加，差异有统计学显著性，但HE染色结果显示并未出现肺气肿等病理表现，说明烟雾暴露大鼠早期即存在肺血管重塑，可能亦提示烟雾可直接作用于肺血管系统诱导肺血管重塑，而并不依赖于缺氧或肺气肿改变等因素［4-5］。研究结果亦显示随烟雾暴露时间延长，模型组WT%和完全肌化血管比例均较对照组明显增大。且从模型组SW-2至SW-12组出现大鼠气道和血管周围炎性细胞浸润逐渐加重，肺血管壁逐渐增厚，烟雾暴露SW-12组管腔狭窄，肺动脉壁增厚最明显，S-12W与S-2W比较，W/T和完全肌化血管比例差异均有统计学显著性，说明随着烟雾暴露时间延长，肺血管重塑程度逐渐加重。本研究结果还显示，对照组肺动脉平滑肌细胞PCNA 及α-SMA无阳性染色，S-2W肺动脉平滑肌细胞胞核PCNA及α-SMA弱阳性染色，S-12W组肺动脉平滑肌细胞胞核PCNA及α-SMA强阳性染色，表明PCNA阳性细胞随肺血管重塑加重而增多，两者呈正相关。因此可认为，烟雾暴露后的大鼠早期即可出现肺小血管平滑肌细胞的增殖，其肺血管平滑肌细胞增殖与肺血管重塑程度密切相关，肺血管重塑与烟雾暴露时间呈正相关趋势。

Figure 2.The protein expression of α-SMA，PCNA and TGF-β1 in the pulmonary arteries detected by immunohistochemistry (×200).图2 免疫组化检测各组大鼠肺动脉α-SMA、PCNA和TGF-β1的表达

Figure 3.The mRNA expression of TGF-β1 in the pulmonary vessels detected by RT-qPCR.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs S-2W group.图3 RT-qPCR法检测各组大鼠肺血管TGF-β1的mRNA表达水平

有研究表明，烟雾暴露导致的肺血管重塑和肺血管内某些细胞因子表达上调密切相关［6］。TGF-β1是调控细胞增殖、分化的重要因子，能促进血管平滑肌细胞、成纤维细胞等细胞增殖及表型转化和血管重塑。本研究结果显示，对照组肺动脉TGF-β1无阳性染色，S-2W组肺动脉平滑肌细胞胞浆TGF-β1蛋白弱阳性染色，而S-12W组肺动脉平滑肌细胞胞浆TGF-β1蛋白强阳性染色，差异均具有统计学显著性。研究结果表明肺动脉平滑肌TGF-β1蛋白表达随烟雾暴露时间延长而表达增加。在 S-12W组TGF-β1的mRNA表达高于S-2W组，两组间差异具有统计学显著性，进一步说明肺动脉血管平滑肌TGF-β1蛋白表达与烟雾暴露时间呈正相关趋势。烟雾暴露可促进气道炎症反应，激活淋巴细胞、肺泡巨噬细胞和中性粒细胞等炎性细胞，从而释放多种炎症因子，如肿瘤坏死因子-α、基质金属蛋白酶，这些炎症因子进一步激活TGF-β1［7］，使得TGF-β1表达上调。TGF-β1可调节人体动脉包括肺动脉的收缩和肺血管平滑肌细胞的增生肥大，加快细胞从G0/ G1期到G2/M+S期的进程，从而促进肺动脉平滑肌细胞的增殖［8］。

本研究中免疫组化和RT-qPCR结果显示，与对照组比较，模型组(SW-2和SW-12)烟雾暴露大鼠肺动脉TGF-β1蛋白表达分别呈阳性，且TGF-β1的mRNA水平和蛋白水平随着烟雾暴露时间延长逐渐增加。同时，不同模型组(SW-2和SW-12)中TGF-β1的mRNA和蛋白表达水平与WT%和完全肌化血管比例呈正相关关系，并与PCNA及α-SMA呈显著正相关。这说明烟雾暴露大鼠诱导的肺血管重塑与肺动脉平滑肌细胞增殖有关，而TGF-β1可能作为参与肺动脉平滑肌细胞增殖的关键细胞因子之一，故推测可能存在TGF-β1依赖性肺血管平滑肌细胞增殖的肺血管重塑。文献报告肺动脉按解剖学分支可分为大动脉组(包括肺动脉干和肺内1级主干)，中动脉组(肺内主干2、3级分支)及小动脉组(肺内动脉4级以上分支)，结果显示不同分支的平滑肌细胞形态无明显差异，但其迁移和增殖能力的改变因血管级别而有所不同［9］。本研究选用右肺动脉观察肺小血管重塑及TGF-β1的mRNA表达在理论上有其合理性，但仍存在一定的欠缺和不足。

综述以上表明，长期烟雾暴露可能通过上调大鼠肺血管TGF-β1蛋白的表达，诱导肺血管平滑肌细胞增殖，导致肺血管重塑和肺动脉高压的形成。但是，TGF-β1信号通路的分子机制尚未被完全阐明，因此，对于TGF-β1在肺动脉高压中的具体作用机制，特别是信号受体的细胞内靶基因和特异性表达模式，还需要我们进行更加深入地研究和探索。

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［3］ 韩素霞，唐梅芳，王 娟，等.氯沙坦钾通过调控ACE2对慢性香烟烟雾诱导的大鼠肺动脉重构的治疗作用［J］.重庆医科大学学报，2014，39(10):1363-1367.

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(责任编辑:陈妙玲，罗 森)

Effects of long-term cigarette smoke exposure on pulmonary vascular remodeling and TGF-β1 expression in rat pulmonary vessels

PENG Hong-xing，YANG Rong-shi，WANG Huan，ZENG Yu-lan

(Department of Respiratory Medicine，Liyuan Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430077，China.E-mail:381154131@qq.com)

AIM:To observe the effects of long-term cigarette smoke exposure on pulmonary vascular remodeling and the protein expression of transforming growth factor-β1(TGF-β1)in the rats，and to explore the mechanism.METHODS:SD rats(n=36)were randomly divided into control group，2-week smoke exposure(S-2W)group and 12-week smoke exposure(S-12W)groups.HE staining and α-smooth muscle actin staining were performed to observe the pulmonary vascular remodeling.The protein expression of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)and TGF-β1 in the pulmonary arteries was determined by the method of immunohistochemistry.The mRNA expression of TGF-β1 in the pulmonary arteries was evaluated by RT-qPCR.RESULTS:Compared with control group，ratio of pulmonary vessel wall thickness to vessel diameter(WT%)and percentage of muscularized vessels were significantly increased in S-2W group and S-12W group(P＜0.01).Significant increases in the protein expression of PCNA and TGF-β1 in smoke exposure groups were observed compared with control group.There was significant difference between 2 model groups(P＜0.01).Compared with control group，the mRNA expression of TGF-β1 in pulmonary artery walls obviously increased in smoke exposure groups.There was significantly difference between S-2W and S-12W groups(P＜0.05).The mRNA expression of TGF-β1 was positively correlated with pulmonary vascular muscularization，WT%and the protein expression of PCNA.CONCLUSION:Long-term cigarette smoke exposure results in pulmonary artery remodeling in rats.The possible mechanism is that cigarette smoking exposure induces the over-expression of TGF-β1 at mRNA level in pulmonary vessels and promotes the proliferation of pulmonary vascular smooth muscle cells in rats.

Cigarette smoke;Pulmonary vascular remodeling;Transforming growth factor-β1;Smooth muscle

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2016.07.029

1000-4718(2016)07-1327-05

2016-01-22

2016-04-01

湖北省自然科学基金资助项目(No.2013CFB078)

△Tel:027-86773985;E-mail:381154131@qq.com