人外周血基因组DNA提取的影响因素及方案选择

张 振，杨文涛，陈 炯，冯 巍

·综述·

人外周血基因组DNA提取的影响因素及方案选择

张 振1，杨文涛2，陈 炯1，冯 巍1

目的 人外周血是基因组DNA样品的主要来源之一，了解外周血基因组DNA提取的研究进展，有助于法医检案中选择并优化DNA提取方案。方法 回顾外周血基因组DNA提取的主要环节和影响因素，综述文献进行比较研究。结果 白细胞裂解是决定DNA提取产量和质量的关键环节，去污剂是各种白细胞裂解液的核心组分。裂解后DNA分离纯化是影响DNA提取的另一重要环节，目前固相介质分离纯化法应用较广。实验室手工方案在一般实验室处理小批量样品时仍具有独特优势，试剂盒方案目前应用较为广泛，自动化提取系统尤其适用于大批量样品处理。然而，任何方案均不能同时满足DNA产量与质量、操作时间、安全性、费用等指标的同时最优化的要求。结论 人外周血基因组DNA提取方案众多，需综合考虑DNA提取效能、操作时间、安全性、费用、设备和试剂易得性等多种因素，选择适宜的DNA提取方案。

外周血；基因组DNA；DNA提取

从临床诊断到生物医学基础研究，外周血样品(以下简称“血样”)一直是最常用的生物检材之一[1]，能否从中提取高产量、高质量基因组脱氧核糖核酸(genomic deoxyribonucleic acid，gDNA)是限制后续DNA分子操作的关键环节。血样gDNA提取方案众多，其机制不一，简繁各异，耗费不等，安危有别，因而迄今尚无公认的普适性方案[2-4]。因此，有必要把握血样gDNA提取的主要环节及其操作原理，并了解各种方案的提取效果，才能针对自身实验目的和实际条件，选择并优化方案。本研究综述相关提取方案，以期为选择并优化实验方案提供参考。

1 血样基因组DNA提取的主要环节及影响因素

一般而言，血样gDNA提取包含如下操作环节：白细胞分离，白细胞裂解，DNA分离纯化。现有血样gDNA提取方法，均源自于上述操作的增删或者改良，见图1。

1.1 白细胞分离

人类外周血中，每微升仅包含有核白细胞约4 000～10 000个，血清、红细胞、血小板等其他组分中包含大量蛋白质、脂类、多糖、无机盐及小分子物质，可不同程度地抑制扩增酶、限制性内切酶、连接酶等多种生物酶活性[5]。因而，白细胞成分洗涤分离，成为许多血样gDNA提取方案的起始步骤。

对于新鲜或冷藏抗凝血样，静置或离心后，富集的白细胞层可直接转移至新管，加入等渗的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)或生理盐水，反复洗涤，即可获得较为纯净的白细胞成分。这种白细胞直接分离操作，通常用于较多量的血样(5 mL以上)。实际上低渗液洗涤法更为常用，该法又称为全血裂解法。利用细胞渗透脆性差异，血样中加入低渗洗涤液而后离心，可除去非白细胞成分。有多种低渗洗涤液可供选择，最简单的就是去离子水[6]，应用最为广泛的则是红细胞裂解液(20 mmol·L-1Tris-Cl,pH7.6)，还有文献在10 mmol·L-1Tris-Cl(pH7.5～8.0)缓冲液的基础上，添加蔗糖、MgCl2、Triton X100、KCl、EDTA 、NP-40、NH4Cl等[7-10]。 冻融过程对血细胞膜结构破坏显著，因此，通常使用等渗PBS洗涤冻藏抗凝血[11]。也有文献报道，-20 ℃保存15～30 a的冻藏血样，使用低渗TE缓冲液洗涤，也可以有效分离白细胞成分[9]。

实际工作中，具体选择哪种或哪几种白细胞分离方法，其操作原则：既要尽可能彻底去除红细胞、血清等无核成分，同时要尽可能保护白细胞结构稳定性，以免DNA过多损失。

1.2 白细胞裂解

血样gDNA提取方案众多，甚至依据DNA分离纯化措施予以命名及分类，但是方案的核心环节均是白细胞裂解，这是决定DNA提取产量及质量的最关键步骤。

1.2.1 固相裂解 将外周血涂布于医用纱布、棉签、滤纸或FTA卡等固相载体上，干燥脱水，即可裂解血细胞并抑制核酸酶活性。在干燥、避光的室温环境中，干燥血样可长期保存[1]。

1.2.2 液相裂解 纯水就是一种最简单的细胞裂解液，而经典的细胞裂解液几乎都包含蛋白酶、去污剂和盐类。

1.2.2.1 去污剂 去污剂是细胞裂解液的核心组分，是由疏水基团和亲水基团构成的有机化合物。在特定的温度、浓度条件下，去污剂分子在水溶液中形成胶束，后者的疏水中心会结合到蛋白质、脂质的疏水区域，破坏蛋白质—蛋白质、蛋白质—脂质、脂质—脂质之间的非共价连接[12]，从而使DNA游离于裂解体系中。去污剂可分为离子型、两性离子型和非离子型3类，常见的十二烷基硫酸钠 (sodium dodecyl sulfate, SDS)、Triton家族、Tween家族、CHAPS、NP-40等[12]。最常应用的去污剂是SDS，其优点主要包括：①SDS活性强，几乎可以破坏所有脂质、蛋白质的非共价键，从而使细胞膜结构破裂、蛋白质变性[12]。②SDS可增强蛋白酶K消化效果[13]。③各种类型的蛋白质与SDS结合后，都带有相同密度的负电荷，且复合物呈短轴相同的长椭圆棒状[14]，同时，SDS在温度较低时会发生沉淀[15]，因而易于盐析、离心去除。④SDS可溶于70%乙醇溶液，而DNA则溶解度极低，有助于进一步纯化DNA样品。

1.2.2.2 蛋白酶K 蛋白酶K(protease K, PK)是一种广谱、高效的丝氨酸蛋白酶，能够快速消化膜蛋白、组蛋白等结构蛋白，促进DNA游离；能够快速灭活核酸酶，有助于保护游离DNA结构完整性[13,16-17]。与去污剂、尿素、EDTA等共存时，由于底物蛋白质变性、肽链伸展疏松，可极大促进PK消化活性[13]。在宽泛的pH范围内(pH4.0～12.5)，PK均可保持稳定的生物活性[13,16,18]。因此，PK是很多细胞裂解方案的优选要素，尤其适用于超高分子量gDNA提取。

1.2.2.3 盐类 细胞裂解液中盐类的作用，主要有调节酸碱度(Tris-Cl)、抑制内源性核酸酶(EDTA)、稳定核酸结构(Tris-Cl、NaCl)、促进去污剂胶束形成(NaCl)等。经典的细胞裂解液一般包含PK、SDS、Tris-Cl 、EDTA 、NaCl等。要提取高分子量的、较纯净的gDNA，通常首选含蛋白酶K和去污剂的细胞裂解液，这也是多数商品化试剂盒的优选方案[19-20]。PK消化通常是DNA提取的限速环节，为了缩短操作时间，也可以不用PK，使用含Tris饱和酚[9]、盐酸胍[21]、SDS[8,10,22-23]或洗衣粉[7]的细胞裂解液，甚至直接加热温育[24]，也能实现白细胞裂解并游离DNA的目的。此外，根据盐离子浓度，细胞裂解液也可分为中盐[7,9,11,23]、高盐[8-10,25-26]缓冲液。

一般而言，白细胞裂解液的使用原则是：确保破坏白细胞结构，充分游离并保护DNA，且应保持DNA浓度适中，以便于后续DNA分离纯化。然而，各种白细胞裂解液的组分及比例差异显著，血样与裂解液的体积比、孵育温度及时间等因素也各不相同。同时，白细胞裂解液组成还受到上游白细胞分离、下游DNA分离纯化环节的多因素影响。因此，如何根据实验目的优化白细胞裂解液配方及操作条件，依然是一个有待深入研究的重要问题。

1.3 DNA分离纯化 如何尽可能去除蛋白质、脂类、多糖及其他小分子物质，同时保证DNA产量及结构完整性，是DNA分离纯化阶段的核心问题。此外，DNA提取方法尚无公认的命名及分类标准，大多依据DNA分离纯化措施予以确定。

1.3.1 有机试剂法

1.3.1.1 酚—氯仿 酚—氯仿抽提是最经典的DNA分离纯化方法[1]。这种方法能够充分除去蛋白质、脂质、色素等混杂物质[9]，得到高纯度DNA[27]，且不需要特殊设备。但是，苯酚具有强烈腐蚀性，而氯仿具有肝毒性和致癌性，因此，可以使用特殊离心管进行酚—氯仿抽提DNA，利用硅质凝胶(silica gel polymer)封闭下层有机相，以避免有机试剂危害[28]。此外，使用低毒性苯甲醇(benzyl alcohol)，替代苯酚、氯仿，也能有效分离gDNA[29]。

1.3.1.2 甲酰胺 甲酰胺(formamide)是一种离子化有机溶剂，能解离蛋白质-DNA复合物，并使蛋白质变性游离。在细胞裂解混合物中，加入1.25倍体积的高浓度甲酰胺变性缓冲液，而后反复透析操作，即可得到长达7 200 kb的gDNA。但是，这种方法操作时间长，DNA损失严重[21]。

1.3.2 盐析法 利用溶解度差异分离蛋白质与DNA，即是盐析法分离纯化DNA的理论基础。盐析通常使用终浓度1.2～1.8 mol·L-1的NaCl[8, 25, 30]或者0.75 mol·L-1的KAc[23]。盐析法几乎避免了有机试剂法的所有缺点，操作简便，因而可用于批量血样处理。缺点则是DNA纯度(蛋白质残留)不够稳定，但通常A260/A280也能达到1.8左右[2]。

1.3.3 固体介质法 固体介质种类繁多，一般基于分子筛效应(size exclusion chromatography，SEC)、离子交换(ion-exchange chromatography，IEC)或亲和作用(affinity chromatography，AC)，实现核酸的分离纯化[1]。与纯液相操作方法相比，利用固体介质分离纯化DNA，受人为因素干扰小，操作稳定性高，且非常适用于大批量核酸提取，因而被绝大多数商品化试剂盒所采用[1,4,31]。不过，此类方法通常费用较高[2]。

1.3.3.1 硅质介质(silica matices) 在高离序盐环境中(胍盐、高氯酸盐、碘盐和醇等)，DNA 能被硅质介质特异性地吸附，经一系列快速漂洗操作，去除非特异性吸附的杂质，而后使用低盐溶液或去离子水洗脱[31-33]。此类商品化试剂盒很多，如NucleoSpin®、UltraClean®、BloodSpin®、QIAamp®、Wizard®、EconoSpin®、GenElute®等，通常40～60 min，即可得到较高纯度的gDNA[31]。

1.3.3.2 离子交换树脂(ion exchange resins) Chelex-100由苯乙烯、苯二乙烯共聚体构成，对多价金属离子有强烈的螯合效应，从而抑制DNA降解，是法医遗传学提取血样gDNA的最常用方法[34-35]。血样经简单洗涤后，加入Chelex-100，直接加热孵育，DNA即可释放、游离于上清液中。该法操作简单快捷，可用于微量血样处理，但所提取DNA样品杂质较多，长期保存易于降解，且DNA呈单链形式的较短片段，通常仅用于PCR，而不适用于限制性酶切、克隆等分子操作[31,34-35]。二乙氨基乙基纤维素(diethylaminoethyl cellulose，DEAE-C)是一种弱碱性阴离子交换树脂，在特定pH和盐浓度下，可特异性结合DNA，而后快速漂洗，去除RNA、多糖等非特异性结合物，从而得到纯净的gDNA样品[4,36]。

1.3.3.3 磁珠(magnetic beads) 利用磁珠法提取gDNA，通常采用硅质膜包被的生物磁珠。在Chaotropic盐体系[33]或Kosmotropic盐体系[37]中，硅质膜磁珠特异性吸附核酸，形成核酸—磁珠复合体。该复合体可通过磁场分离而无需离心，经快速洗涤和溶解，即可得到理想的DNA[38-39]。该方法可处理微量血样(30 μL)，DNA产量高、质量好，尤其是不需离心，操作简单、快速而高效，易于实现自动化，便于大批量血样处理，因而也是当前试剂盒的重点研发方法[1,3,6,39-40]。

2 gDNA提取方案的比较

理想的DNA提取方案应满足以下要求：DNA产量与质量满足研究要求，结果稳定，样品污染风险低，操作简便，快速，安全，费用低廉，不需特殊设备等[22,31]。尽管血样gDNA提取方案(包括试剂盒)多达数十种，但任何一种方案都很难同时满足上述要求[31]。Lahiri等[22]采集5份EDTA抗凝血，比较研究了11种DNA提取方案，这些方案均为手工操作，不涉及试剂盒试剂或固体介质。结果Lahiri-A法产量最高，5 mL全血可得(210±28)μg的DNA；Promega法产量最低，仅(55±2)μg。11种方案的A260/A280比值为1.70～1.94之间，而是否使用苯酚、氯仿，对DNA纯度影响不甚明显。所得DNA片段长度均大于23 kb，仅Kunkel法出现相对明显的DNA降解现象，全部DNA样品均能满足RE酶切、Southern blot。在操作时间方面，Lahiri-A法、Lahiri-B法仅需1 h，速度最快，见表1。

商品试剂盒使用固定的缓冲液和固体分离介质，极大改善了DNA提取效率和稳定性。Chacon-Cortes等[2]搜集了11份长期冻藏血样(-80 ℃，8 a以上)，选择了一种传统盐析提取、改良硅珠盐析提取和试剂盒硅质膜纯化柱，比较三者DNA产量、纯度、每样品费用和操作时间等，见表2。

表1 11种gDNA手工提取方案的比较

注：文献来源：J Biochem Biophys Methods,1992,25(4):193-205。

表2 gDNA手工与试剂盒提取方案比较

注：O/N：过夜。文献来源：Mol Biol Rep,2012,39(5):5961-5966。

Lee等[41]比较研究了3种自动化DNA提取系统，全血提取gDNA，并计算了每微升全血DNA校正产量。3种系统的操作时间、提取效率没有显著差异，都能得到高质量gDNA，见表3。

表3 3种自动化DNA提取系统比较

注：结果为每μL血样的DNA产量。文献来源：Yonsei Med J,2010,51(1):104-110。

3 血样基因组DNA提取方案选择

血样gDNA提取方案可粗略划分为3类：实验室手工方案、半自动化试剂盒方案和全自动化提取系统。

3.1 实验室手工方案 实验室手工方案中，综合考虑DNA产量与质量、安全性、操作时间、费用等因素，最优方案应该是“白细胞洗涤分离+SDS细胞裂解+NaCl盐析+醇沉淀纯化DNA”。该方案无需特殊场地和设备，试剂及耗材低廉，安全无毒害，操作简单，所有步骤都能灵活调整，适用于一般实验室小批量提取血样gDNA。但是，此类方案的试剂配制步骤繁琐，操作费时费力，结果不够稳定。因此，寻求一种快速、简单、廉价的手工提取方案，仍然具有重要的研究及应用价值。

3.2 试剂盒方案 试剂盒方案基本克服了传统手工操作方案的缺点，尤其是硅质膜纯化柱法、磁珠法，已经成为血样gDNA提取的主流策略，广泛应用于生命科学各领域。然而，样品量过大时，超过固体介质吸附能力，可能导致DNA损失或杂质残留，仍然是试剂盒方案的弱点。此外，特殊设备(如磁力架)和费用仍然远大于手工方案。

3.3 自动化提取系统 试剂盒联用自动化工作站系统，能完全摆脱手工操作，可最大限度地减少人为误差的干扰，结果相对稳定，非常适用于临床诊断、疾病控制中心等场所，进行大批量血样处理。但是，需要特殊场地、设备，而且试剂及耗材昂贵。

综上所述，白细胞裂解是决定DNA提取产量和质量的关键环节，去污剂是各种白细胞裂解液的核心组分。裂解后DNA分离纯化是影响DNA提取的另一重要环节，目前固相介质分离纯化法应用较广。实验室手工方案在一般实验室处理小批量样品时仍具有独特优势，试剂盒方案目前应用较为广泛，自动化提取系统尤其适用于大批量样品处理。因此，人外周血基因组DNA提取方案众多，需综合考虑DNA提取效能、操作时间、安全性、费用、设备和试剂易得性等多种因素，选择适宜的DNA提取方案。

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Influential Factor and Protocols Selection for Genomic DNA Extraction from Human Peripheral Blood Samples

ZHANG Zhen1, YANG Wen-tao2, CHEN Jiong1, FENG Wei1

(1.School of Forensic Medicine, Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China;2.Neixiang County Public Security Bureau,Neixiang 474350, China )

ObjectiveHuman peripheral blood samples were one of the main sources used to obtain genomic deoxyribonucleic acid (gDNA). In order to select the optimal DNA extraction protocol on forensic identification, it would be helpful to investigate the research progress of DNA extraction.MethodsThere reviewed the common procedures adopted by most DNA extraction protocols, and highlighted the principles of its operation and impact factors by searching the representative studies from database.ResultsThe lysis of white blood cell (WBC) was a key step to determine the yield and quality of extracted DNA. Detergents were usually the core component of a variety of WBC lysis solution. Another key step was the separation and purification of free DNA which usually involved some solid media. The manual protocols had still common alternatives for DNA extraction from peripheral blood samples, especially when a few samples were processed in small laboratories. A variety of DNA extraction kits had been widely used at present. Several automated systems for gDNA extraction were very suitable for treating the large quantities of blood samples. However, there was not enough scientific evidence to support one particular DNA extraction method from whole blood samples in terms of DNA yield and quality, time consumption, safety, and cost.ConclusionThe optimal choice for gDNA extraction had still based on comprehensive consideration of multiple items, such as DNA extraction efficiency, time consumption, safety, cost, and availability of equipment and reagents from variety protocols.

peripheral blood；genomic DNA；DNA extraction

1672-688X(2016)04-0310-06

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.022

国家自然科学基金(81501634) 河南科技大学高级别项目培育基金(012ZCX021)

2016-07-25

1.河南科技大学法医学院，河南洛阳471003 2.内乡县公安局，河南内乡474350

张振(1973-)，男，河南淮阳人，博士，讲师，从事法医遗传学研究工作。

D919.2

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