西安地区宫颈病变妇女人乳头瘤病毒感染状况及基因型别分析

崔亚杰，张培莲，卢天捷，黄喜英，吕淑兰

(1.西安市第一医院妇产科，陕西 西安 710002；2.西安交通大学第一附属医院妇产科,陕西 西安 710061)



西安地区宫颈病变妇女人乳头瘤病毒感染状况及基因型别分析

崔亚杰1，张培莲1，卢天捷1，黄喜英1，吕淑兰2

(1.西安市第一医院妇产科，陕西 西安 710002；2.西安交通大学第一附属医院妇产科,陕西 西安 710061)

[摘要]目的回顾性分析西安地区宫颈病变妇女人乳头瘤病毒(HPV)感染状况及基因型别，为宫颈病变的防治提供临床资料和依据。方法收集2010年1月至2013年12月在西安市第一医院及陕西友谊检验中心病理诊断为宫颈癌和宫颈上皮内瘤变(CIN)的450例女性宫颈组织石蜡标本，应用Hybrimax基因芯片导流杂交技术对标本进行HPV基因型分型检测。比较宫颈癌及不同级别宫颈上皮内瘤变组HPV感染状况及基因型别并进行分析。结果①低度、高度宫颈上皮内瘤变及宫颈癌组织中均存在高危型HPV感染，20～29岁年龄组常存在低危型HPV感染，感染率为20%，χ2=29.98，P<0.0001，与其他年龄组有明显的统计学差异；②HPV感染的高危型主要是16、58、18、31，低危型主要是11、43、42、6、44。结论HPV感染基因型别在不同宫颈病变中有不同表现，高危型HPV持续感染是宫颈癌及宫颈上皮内瘤变发生发展的必要条件。

[关键词]宫颈上皮内瘤变；宫颈癌；人乳头瘤病毒；基因亚型

宫颈癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤，在发展中国家，宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中居第1位。资料显示，每年全世界大约有50万人患宫颈癌，其中约30万左右患者死亡，发展中国家占80%；近年来宫颈癌发生有年轻化趋势，在我国每年约有10万新发病例，是世界宫颈癌新发病例的四分之一。已知人乳头瘤病毒( human papillomavirus，HPV)感染是宫颈癌发生的确切病因。目前已知的HPV亚型有100余种，其中人类生殖道可感染30多种亚型并导致宫颈病变。不同地域性研究资料表明，全球HPV感染的最主要型别是HPV-16，而其他亚型的感染率存在着较大的地域差异,通过对以下资料分析，研究西安地区不同HPV基因型别感染与宫颈病变的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象

1.2实验方法

主要应用PCR体外扩增和DNA反向杂交的DNA芯片技术。首先依据HPV的基因特点设计出特异引物，并应用PCR体外扩增技术扩增出23种HPV基因型的目标片段，之后将扩增产物与固定在膜条上的23种HPV基因型的分型探针进行杂交，并根据杂交信号来判断是HPV基因型的存在。其中检测的23种HPV基因型分别包括高危型18种(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、MM4、73、83)和低危型5种(HPV6、11、42、43、44)。使用基因芯片技术可对HPV DNA进行分型诊断，还可判断多重感染。

1.2.1组织DNA的提取

将新鲜组织剪成大约1mm×3mm的组织块，切取4mm厚度组织片4张，取病灶点，去石蜡，放入1.5mL灭菌离心管中，加入裂解液，沸水浴加热10分钟，13000rpm离心10分钟，留上清液待用。

1.2.2 PCR扩增

取提取液5μL加入内有PCR反应液20μL的反应管中，低速离心，避免污染，设置阳性和阴性质控，共40个循环。

1.2.3杂交

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取15mL塑料离心管，放入标有样本编号的膜条、PCR产物25μL及A液5mL，将离心管放入沸水浴中加热10分钟后取出，放入杂交箱51℃杂交1.5小时。50mL塑料离心管，加入50mL B液，放入杂交箱内预热至51℃待用。

1.2.4洗膜

取出膜条，将膜条置入装有50mL B液的离心管内，51℃轻摇洗涤5分钟。

1.2.5显色

配制孵育液，室温轻摇孵育30分钟；A液摇洗2次，每次5分钟；C液室温洗膜1～2分钟；配显色液，膜条浸入避光显色至少30分钟；去离子水浸泡后，观察结果。

1.3统计学方法

运用SPSS 20.0进行统计分析，对于多型感染，需对各亚型的检出率重复计算。对于HPV感染率的差异比较采用卡方检验，P<0.05表示差别有统计学意义。

2结果

2.1 人乳头瘤病毒感染在不同年龄段及宫颈病变中的分布

CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及宫颈癌组织中高危型HPV感染率为100%。20～29岁年龄组常合并低危型HPV感染，感染率为20 %，明显高于其他年龄组(χ2=29.98，P<0.05)。HPV感染在不同年龄段及宫颈病变中的分布见表1。

表1　HPV感染在不同年龄段及宫颈病变中的分布情况[n(%)]

2.2高危型人乳头瘤病毒感染在宫颈病变病例中的基因型别

在不同宫颈病变中常见高危型HPV感染的基因型别有所不同，CINⅠ常见的HPV型别主要是：16(20%)、58(12%)、51(10%)；CIN Ⅱ是16(25%)、31(17%)、33(15%)；CIN Ⅲ是16(36%)、52(15%)、31(10%)；宫颈癌是16(80%)、18(11%)、52(5%)；宫颈癌中HPV16感染率明显高于CIN，有统计学差异，P<0.05。高危型HPV感染在宫颈病变病例中的基因型别见表2。

表2高危型HPV感染在宫颈病变中的基因型别比例[n(%)]

Table 2　Proportion of genotype in cervical lesions with high-risk HPV infection[n(%)]

3讨论

3.1宫颈病变合并人乳头瘤病毒感染与年龄的关系

本研究资料显示宫颈上皮内瘤变好发年龄为30～49岁之间，宫颈癌好发年龄为40～59岁。低度、高度宫颈上皮内瘤变及宫颈癌组织中均可见高危型HPV感染，说明高危型HPV感染与宫颈癌及CIN密切相关，研究结果与高危型HPV 感染是宫颈癌发生必要条件的观点一致。20～29岁年龄组常合并低危型HPV感染，感染率为20%，明显高于其他年龄组。王颖[1]研究表明20岁之前结婚宫颈癌发病率为1.58%；宫颈癌发病率21岁以后结婚者较20岁之前结婚者明显下降，仅为后者的1/4，Zheng[2]研究发现性生活过早是宫颈癌发生的高危因素之一。说明HPV感染可能与性行为活跃及多个性伴侣有关，当HPV感染呈持续状态，宫颈癌的风险也明显增高。

3.2 人乳头瘤病毒基因型别与不同宫颈病变的关系

HPV有200多种亚型，根据致病力的不同分为高危型和低危型2种[3]，在HPV的各亚型中已证实HPV16、18与宫颈癌的发病关系密切[4]，尤其伴淋巴转移者检出率较其他宫颈病变者明显升高[5]。表明HPV16、18是宫颈癌发展过程中的关键因素。本研究表明在宫颈病变中，高危型HPV 感染的基因型别主要为：16、58、18。但HPV基因型别在不同宫颈病变中有不同表现:CIN Ⅰ常见的HPV 型别主要是: 16、58、51；CIN Ⅱ是16、31、33；CIN Ⅲ是16、52、31；宫颈癌是16、18，与以往的研究结果一致。

3.3 人乳头瘤病毒感染的地区差异及分布

多项研究显示HPV 感染的亚型分布具有一定的地域性差异，欧洲地区以16、31、18型为主，南美地区以16、58、18型为主。我国HPV感染类型也呈现地区差异，中国南方地区52、58 亚型的感染率高于北方地区。廖秦平[6]报道北京地区妇女宫颈感染的主要亚型是HPV 52、58，并且该两型之和高于16、18 亚型。惠凌云等[7]报道西安地区HPV感染以16型、58型、35型、18型、6型为主。本资料中西安地区妇女宫颈病变中，高危型HPV 感染的基因型别主要是：16、58、18。本研究发现西安地区低度宫颈上皮内瘤变常见的HPV基因型别主要是: 16、58；CIN Ⅱ是16、31； CIN Ⅲ 是16、52，宫颈癌常见的HPV基因型别主要是16、18。本研究发现：低度、高度宫颈上皮内瘤变及宫颈癌组织中均可见HPV高危型感染，与高危型HPV感染是宫颈癌发生必要条件的观点一致。但高危型感染率均为100%，这样的研究结果可能与样本量较小有关，在未来的研究工作，应该增加样本量，减小偏倚，从而证实这一研究结果。由于目前国际上还没有公认的治疗HPV 感染的药物，因此对HPV感染以预防为主。目前研究HPV疫苗成为热点。但现已上市的HPV疫苗，仅对HPV16、18型感染有效，但HPV型别分布存在明显的地区差异。本研究使用基因芯片技术对HPV DNA进行分型诊断，同时进行多重感染检测，将为研制出适合西安地区的预防性HPV疫苗提供参考依据，也为我国的HPV疫苗研究提供数据资料。

3.4不同宫颈病变中人乳头瘤病毒多重感染率

本研究表明不同宫颈病变中HPV多重感染率CIN Ⅰ40%，CIN Ⅱ和CIN Ⅲ 27.5%，宫颈癌22%。Lee等[8]认为多重感染比单一型别感染者发生宫颈癌的危险性高。本资料显示在高度CIN及宫颈癌的发病率中，单一感染和双重以上感染两组之间无明显差别。

在西安地区，对于HPV 16、18、31、52、58 等高危亚型感染的患者要做到密切随访，以便及时发现病变并给予干预，但也应合理分析其导致高度宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的风险，避免过频的复查和过度治疗。

[参考文献]

[1]王颖.宫颈癌发病相关因素的研究分析[J]实用预防医学,2014,21(3) : 345-347.

[2]Zheng J. Diagnostic value of MCM2 immunocytochemical staining in cervical lesions and its relationship with HPV infection [J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(1): 875-880.

[3]McLaughlin-Drubin M E,Meyers J,Munger K.Cancer associated human papillomaviruses[J].Curr Opin Virol,2012,2(4):459-466.

[4]王朝晖,李玉中,宋丽媛，等.TSHR蛋白在宫颈癌的表达及其与HPV-16感染的关系[J].中国微生态学杂志,2013,25(11):1267-1269.

[5]Aguilar-Lemarroy A,Vallejo-Ruiz V,Cortés-Gutiérrez E I,etal.Human papillomavirus infections in Mexican women with normal cytology, precancerous lesions, and cervical cancer: type-specific prevalence and HPV coinfections[J].J Med Virol,2015,87(5):871-884.

[6]廖秦平.要真正理解和重视人乳头瘤病毒感染[J].中国实用妇科与产科杂志,2010,26(5):321-323.

[7]惠凌云,王亚文,冯艾,等.西安市1 650例已婚妇女宫颈细胞HPV感染调查分析[J].中国妇幼健康研究,2012,23(6):738-741.

[8]Lee S A,Kang D,Seo S S,etal.Multiple HPV infection in cervical cancer screened by HPVDNAChip[J]. Cancer Lett, 2003,198(2):187-192.

[专业责任编辑：安瑞芳]

[收稿日期]2016-01-13

[基金项目]陕西省社会发展科技攻关资助项目(项目编号：2015SF185)。

[作者简介]崔亚杰(1974-)，女，副主任医师，硕士研究生，主要从事妇科肿瘤的研究。

[通讯作者]吕淑兰，教授。

doi:10.3969/j.issn.1673-5293.2016.07.011

[中图分类号]R711.74

[文献标识码]A

[文章编号]1673-5293(2016)07-0819-03

Study on genotypes and infection of human papillomavirus in cervical lesions of women in Xi’an area

CUI Ya-jie1, ZHANG Pei-lian1, LU Tian-jie1, HUANG Xi-ying1, LYU Shu-lan2

(1.Department of Obstetrics and Gynecology, Xi’an First Hospital, Shaanxi Xi’an 710002, China;2. Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Shaanxi Xi’an 710061, China)

[Abstract]Objective To conduct a retrospective analysis of human papillomavirusm (HPV) infection status and genotypes of women with cervical lesions in Xi’an so as to provide clinical data and basis for prevention and treatment of cervical lesions. Methods Cervical tissue paraffin specimens of 450 cases of cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia (CIN) were collected in Xi’an First Hospital and Shaanxi Youyi Inspect Center from January 2010 to December 2013. Hybrimax flow-through hybridization technique was used to detect HPV genotype of the specimens. HPV infection and genotype were compared among cases of cervical cancer or different grades of CIN. Results There was high-risk HPV infection in cases of CIN and of cervical cancer. Low-risk genotypes of HPV infection was often observed in 20-29 aged cases, and the rate was 20% (χ2=29.98,P<0.0001). There was significant difference from that of other aged cases. The high-risk genotypes of HPV infection majored in 16, 58, 18 and 31, while the low-risk genotypes mainly were 11, 43, 42, 6 and 44. Conclusion HPV genotypes have different clinical features in case with different cervical lesions. High-risk HPV infection is a necessary condition for cervical cancer and CIN development.

[Key words]cervical intraepithelial neoplasia (CIN); cervical cancer; HPV; genotype