白姑鱼胰蛋白酶的分离纯化及其性质分析

李 欢，李 婷，詹云超，杜翠红*（集美大学食品与生物工程学院，水产品深加工技术国家地方联合工程研究中心，福建 厦门 361021）



白姑鱼胰蛋白酶的分离纯化及其性质分析

李 欢，李 婷，詹云超，杜翠红*
（集美大学食品与生物工程学院，水产品深加工技术国家地方联合工程研究中心，福建 厦门 361021）

摘 要：本研究从白姑鱼幽门垂组织中提取胰蛋白酶粗酶，然后经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析及Sephacryl S-200凝胶过滤层析等分离纯化技术，得到一种阴离子型胰蛋白酶（命名为：Trypsin A），并对该阴离子型胰蛋白酶进行鉴定及性质分析。结果表明：Trypsin A的分子质量约为28 kD，其最适反应温度为50 ℃，能在低于65 ℃条件下保持稳定；最适pH值为9.5，酸碱耐受范围为pH 9.5～11.0；Western blotting分析表明，白姑鱼阴离子型胰蛋白酶可以与抗鲫鱼胰蛋白酶抗体反应，符合胰蛋白酶活性区域的高度保守性；丝氨酸类蛋白酶抑制剂对白姑鱼胰蛋白酶具有抑制作用。

关键词：白姑鱼；胰蛋白酶；分离纯化；酶学性质

引文格式：

李欢， 李婷， 詹云超， 等.白姑鱼胰蛋白酶的分离纯化及其性质分析［J］.食品科学， 2016， 37（13）: 168-172.DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201613030. http://www.spkx.net.cn

LI Huan， LI Ting， ZHAN Yunchao， et al.Purification and characterization of trypsin from white croaker （Argyrosomus argentatus）［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 168-172.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613030. http://www.spkx.net.cn

白姑鱼（Argyrosomus argentatus，英文名：white croaker）为鲈形目石首鱼科白姑鱼属，生活在海洋中下层。在我国南海、东海及黄海南部都有分布，但产量并不高。其肉厚而细嫩，是海洋经济型食用鱼，鱼干用于出口日本等国。作为鱼内脏主要的内源性水解酶，胰蛋白酶的研究在国内外已有报道，如日本的Sappasith等［1-3］分别分离纯化出竹夹鱼（Pomatomus saltatrix）和金枪鱼（Thunnus albacores和Thunnus tonggol）的胰蛋白酶，并研究了其酶学性质；Liu［4］、Lu Baoju［5］和吕英涛［6］等也分别分离纯化出了点带石斑鱼（Epinephelus coioides）、鳜鱼（Siniperca chuatsi）和鳀鱼（Engraulis japonicus）的胰蛋白酶，并作了研究。但是关于白姑鱼的胰蛋白酶研究尚未见报道。

根据已有相关文献报道，内源性水解酶对于鱼类的自溶过程起到关键作用［7-8］，其中胰蛋白酶的活性最高，对鱼类自溶影响最大［6］。而鱼类自溶现象的产生会大大影响其在贮存和加工过程中的品质，从而影响口感并降低经济价值。基于以上原因，本研究以白姑鱼内脏为原料，通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析及Sephacryl S-200凝胶过滤层析等分离纯化技术，纯化得到一种阴离子型胰蛋白酶（命名为：Trypsin A），并对该酶的酶学性质进行初步研究，以期为该酶的应用、白姑鱼的贮存和加工工艺的改善提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活白姑鱼 厦门集美菜市场。

干酪素 西陇化工股份有限公司；Tris-base和十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美国Sigma公司；蛋白质分子质量标准品 日本TaKaRa公司；阴离子交换层析树脂（DEAE-Sepharose Fast Flow）和凝胶过滤层析树脂（Sephacryl S-200 HR） 美国GE Healthcare公司。

1.2 仪器与设备

垂直电泳槽、BioLogic LP蛋白质纯化层析系统美国Bio-Rad公司；Lambda 35可见-紫外分光光度计美国Perkin Elmer公司；Starter 2100 pH 计 美国Ohaus公司；Avanti J-26S XP高速冷冻离心机 美国Beckman公司；RIOS 8超纯水系统、10 000 MWCO离心浓缩装置 美国Millipore公司；G:BOX凝胶成像装置 英国Syngene公司；FP-6200荧光分光光度计 日本Jasco公司；PT-MR 2100组织捣碎机 瑞士Kinematica公司。

1.3 方法

1.3.1 胰蛋白酶粗酶的提取

对鲜活的白姑鱼敲击头部致其死亡，放入－20 ℃冰箱充分冷却，取其幽门垂组织用蒸馏水冲洗干净，去脂肪及结缔组织后切碎并称质量，按料液比为1∶1（即100 g组织加入100 mL溶液）加入缓冲液A（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5），将悬浮液用组织捣碎机捣碎4～5 次（15 s/次）。在4 ℃、12 000 r/min离心20 min，弃掉沉淀，收集上清液，对上清进行硫酸铵分级沉淀，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集硫酸铵饱和度在30%～70%之间的馏分，用少量缓冲液A溶解沉淀并对其进行透析，得到的溶液即为粗酶液。

1.3.2 胰蛋白酶的纯化

将粗酶液上样于预先用缓冲液A平衡的DEAESepharose Fast Flow阴离子交换层析柱（1 cm×10 cm），并用缓冲液A以1 mL/min 流速充分淋洗，然后用含有NaCl浓度范围为0.05～0.5 mol/L的缓冲液A进行梯度洗脱，洗脱液总体积为200 mL，以每管3 mL进行收集，并分别测其A280 nm值和酶活力，绘制洗脱曲线，将活性峰合并，采用超滤离心管进行超滤浓缩，得到部分纯化的胰蛋白酶。

用缓冲液A平衡凝胶过滤层析柱Sephacryl S-200 HR （1.5 cm×98 cm）后，将述上部分纯化的胰蛋白酶上样于该柱，然后以缓冲液A以流速1 mL/min进行洗脱，每管收集3 mL。并分别测其A280 nm值和酶活力，收集酶活峰即为纯化的白姑鱼阴离子型胰蛋白酶（命名为Trypsin A）。冷冻干燥，－20 ℃保存。

1.3.3 胰蛋白酶活性测定

本研究主要采用以酪蛋白为底物测定反应液的A280 nm值，获得胰蛋白酶的活性，用于胰蛋白酶的分离纯化过程及pH值和温度对其酶活力影响的研究［9-10］。酶活力定义：在特定条件（25 ℃，其他为最适条件）下，在1 min内能转化酪蛋白中1 μmol酪氨酸的酶量为1个酶活力单位。

1.3.4 白姑鱼胰蛋白酶的性质研究

1.3.4.1 白姑鱼胰蛋白酶的分子质量和纯度的鉴定

通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）［11］和Western blotting分析鉴定所纯化的白姑鱼胰蛋白酶的分子质量和纯度。

1.3.4.2 白姑鱼阴离子型胰蛋白酶的最适pH值和酸碱稳定性研究

将经冷冻干燥的酶用不同pH值缓冲液进行溶解：柠檬酸钠缓冲液（pH 3.0～5.5）、磷酸盐缓冲液（pH 6.0～7.0）、Tris-HCl缓冲液（pH 7.5～9.0）、NaHCO3-NaOH 缓冲液（pH 9.5～11.0），缓冲液浓度均为0.1 mol/L，以酪蛋白为底物测定酶的活力。酸碱稳定性的测定：将酶液在室温条件下放置于上述各pH值的缓冲液中30 min后，按照酶活力测定方法测定其酶活力，具体操作见参考文献［4］方法。

1.3.4.3 白姑鱼阴离子型胰蛋白酶的最适温度和热稳定性研究

在上述酶活力测定方法不改变的条件下，温度在30～60 ℃的范围内，10 ℃梯度增加变化，测定该酶的最适作用温度。温度稳定性研究：将酶分别在 30、40、50、55、60、65、70 ℃条件下孵育30 min，测定其酶活力。

1.3.4.4 白姑鱼胰蛋白酶底物特异性的测定

以荧光标记的不同小肽为底物测定胰蛋白酶酶解液的荧光值［5］，以检测其底物特异性。以荧光底物Boc-Phe-Ser-Arg-MCA为对照，通过比较其他来源的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、氨肽酶等荧光底物酶解液的荧光值大小，以确定白姑鱼胰蛋白酶的底物特异性。

1.3.4.5 蛋白酶抑制剂对白姑鱼阴离子型胰蛋白酶的影响

根据不同种类的丝氨酸蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、1，10-邻菲咯啉（1，10-phenanthroline）、胃蛋白酶抑制剂（pepstatin）、苯甲醚（benzamidine）、Pefabloc SC和大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor ，STI）有效终浓度和初浓度，计算各抑制剂需加入的量，然后分别加入至纯化的胰蛋白酶溶液中，此混合物在室温下（20～25 ℃）放置15 min后，用上述酶活力测定方法分别测定酶的酶活力，对照为不加抑制剂的酶液。

2 结果与分析

2.1 白姑鱼胰蛋白酶的分离纯化

对胰蛋白酶粗提液进行硫酸铵分级沉淀，收集硫酸铵饱和度在30%～70%之间的馏分，加入适当缓冲液溶解后，进行透析。然后进行DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析。由图1可知，经过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子柱层析，出现对应的淋洗峰和洗脱峰，即粗酶液被分成未吸附部分和吸附部分。其中，吸附部分即为阴离子型的胰蛋白酶（命名为Trypsin A）。

经过DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析，分别对洗脱峰（第53～60管）中的酶液进行SDS-PAGE检测，由图2可知，从53～60 管，蛋白条带越来越少，纯化效果越来越明显。

由图2可知，第53～58管的酶液中仍存在少量杂蛋白，将其混合后上样于Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析柱。过此柱后分离效果如图3所示，洗脱峰的酶液蛋白条带越来越单一，白姑鱼胰蛋白酶Trypsin A得到了纯化。

2.2 白姑鱼胰蛋白酶Trypsin A的SDS-PAGE检测及其Western blotting鉴定

将分离纯化的白姑鱼胰蛋白酶Trypsin A同时进行SDS-PAGE检测和Western blotting鉴定。其中，Western blotting所用的一抗是兔抗鲫鱼胰蛋白酶多克隆抗体。由图4可知，白姑鱼胰蛋白酶Trypsin A的分子质量为28 kD，白姑鱼胰蛋白酶可以与抗鲫鱼胰蛋白酶抗体呈阳性反应。

2.3 白姑鱼胰蛋白酶Trypsin A的性质研究

2.3.1 白姑鱼胰蛋白酶Trypsin A的最适pH值和pH值稳定性

不同pH值对白姑鱼阴离子型胰蛋白酶的活力影响如图5所示，Trypsin A在pH 9.5左右时表现出的最大酶活力。当pH值低于9.5时，酶活力显著下降。Trypsin A在不同pH值的缓冲液中，室温下经过 30 min水浴孵育处理后，对pH值的稳定性如图5所示，稳定性范围为9.5～11.0，在pH值小于8.0条件下，酶活力非常不稳定。

鱼类胰蛋白酶通常属于碱性蛋白系［12］，在酸性环境下，酶会因为表面电荷分布的改变而不能和底物有效地结合［13］。白姑鱼体内胰蛋白酶的pH值活力适应范围与大西洋鳕鱼（Gadus morhua）［14］、鲤鱼（Cyprinus carpio）［15］、金枪鱼（Thunnus tonggol）［3］以及大西洋鲑鱼（Salmo salar）［16］等鱼体内胰蛋白酶类似，高于弹丸鱼（Balistes capriscus）［17］胰蛋白酶的最适pH值。

2.3.2 白姑鱼胰蛋白酶Trypsin A的最适温度和温度稳定性

白姑鱼胰蛋白酶Trypsin A的温度范围如图6所示，选择温度范围为 30～70 ℃，Trypsin A的最适温度为 50 ℃。当酶在65 ℃以下水浴中经过 30 min的加热处理后，它们的活性仍能很好地保持。当温度大于65 ℃时，酶活力会急剧下降，热稳定性变差。

白姑鱼胰蛋白酶的最适温度与已报道的格陵兰鳕鱼（Gadus ogac）［18］、大西洋狐鲣鱼（Sarda）［19］、沙丁鱼（Sardinops sagax caerulea）［20］等鱼胰蛋白酶相似，而高于鲤鱼（Cyprinus carpio）［15］和凤尾鱼（Engraulis encrasicholus）［21］胰蛋白酶的最适温度，低于罗非鱼（Oreochromis mossambicus）［22］和草鱼（Ctenopharyngodon idellus）［23］胰蛋白酶的最适温度。鱼体内胰蛋白酶的最适温度可能与它们的栖息环境和生活习性有关。

2.3.3 白姑鱼胰蛋白酶Trypsin A的底物特异性

表 1 白姑鱼胰蛋白酶TrypsinA的底物特异性Table 1 Substrate specificity oftrypsinA荧光底物（10 μmol/L） 相对酶活力/% Boc-Phe-Ser-Arg-MCA 100 Boc-Gln-Arg-Arg-MCA 77.5±2.3 Boc-Val-Pro-Arg-MCA 122.8±3.0 Boc-Leu-Arg-Arg-MCA 75.4±1.1 Boc-Leu-Lys-Arg-MCA 60.3±2.8 Boc-Glu-Lys-Lys-MCA 8.7±2.0 Z-Phe-Arg-MCA 112.6±0.9 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA 0 Arg-MCA 18.7±0.6 Ala-MCA 0 Met-MCA 0

白姑鱼胰蛋白酶与各荧光底物反应的结果如表1所示，与其他荧光底物相比，胰蛋白酶对丝氨酸蛋白酶底物Boc-Val-Pro-Arg-MCA的分解能力最强，与鲤鱼（Cyprinus carpio）［15］和狗母鱼（Saurida wanieso）［24］的肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（myofibril-bound serine proteinase，MBSP）的最适荧光底物不一样。当P1位的氨基酸为Arg时，明显强于此位置为Lys，且P2位或P3位的氨基酸残基对酶仍有很大的影响。有研究［24］表明，胰蛋白酶对Arg的分解效率为Lys的2～10 倍。胰蛋白酶对组织蛋白酶底物Z-Phe-Arg-MCA的分解能力比Boc-Phe-Ser-Arg-MCA稍高。但胰蛋白酶对胰凝乳蛋白酶底物Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA和氨肽酶（Arg-MCA、Ala-MCA、Met-MCA）几乎不分解。由此可见，白姑鱼胰蛋白酶Trypsin A的底物特异性与其他鱼类胰蛋白酶的基本一致，但是对于组织蛋白酶底物Z-Phe-Arg-MCA的活性明显偏高，可能是白姑鱼胰蛋白酶不同于其他鱼类胰蛋白酶的特异性质，有待进一步实验验证。

2.3.4 不同抑制剂对白姑鱼胰蛋白酶Trypsin A活性的影响

表 2 蛋白酶抑制剂对白姑鱼胰蛋白酶Trypsin A的影响Table 2 Effectsof proteinaseinhibitors on the activity of trypsin A抑制剂 浓度/（mmol/L） 相对酶活力/% 无0 100 Pefabloc SC 1 0 STI 0.001 0 PMSF 1 5.1±0.8苯甲醚 5 15.1±2.6 Pepstatin 0.02 98.9±1.0 1，10-邻菲咯啉 10 98.5±1.4 EDTA 10 89.7±3.1

不同的蛋白酶抑制剂对白姑鱼胰蛋白酶活性的影响见表2，丝氨酸蛋白酶抑制剂Pefabloc SC和STI在较低浓度时能完全抑制白姑鱼胰蛋白酶的活性，苯甲醚和PMSF对胰蛋白酶活性也几乎完全抑制。天冬氨酸蛋白酶抑制Pepstatin及金属蛋白酶抑制剂EDTA、1，10-邻菲咯啉对白姑鱼胰蛋白酶作用效果不明显。由此可知，表2中蛋白酶抑制剂对白姑鱼胰蛋白酶Trypsin A的抑制作用与其他鱼类胰蛋白酶的基本一致，与胰凝乳蛋白酶的有差异，例如蒙特利沙丁鱼（Sardinops sagax caerulea）［20］、加州对虾（Penaeus californiensis）［25］和乌贼（Sepia officinalis）［26］。但是EDTA对Trypsin A的活性却有10%的抑制，可能是白姑鱼胰蛋白酶的特殊现象，有待进一步研究。

3 结 论

白姑鱼胰蛋白酶作为内源性蛋白水解酶之一，活性高，在白姑鱼的自溶作用中起主要作用。本研究从白姑鱼的幽门垂组织中提取胰蛋白酶粗酶，并通过DEAESepharose Fast Flow和Sephacryl S-200 HR柱层析，纯化得到一种阴离子型胰蛋白酶Trypsin A，并对其酶学性质进行初步研究。结果表明，Trypsin A的分子质量为28 kD，其最适反应温度为50 ℃，且在温度小于65 ℃条件下仍具有很高的酶活力；最适pH值为9.5，pH值的耐受范围为9.5～11.0；该酶对荧光底物P1位的Arg和Lys残基有分解作用，且优先分解Arg残基，对于胰凝乳蛋白酶底物（Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA）和氨肽酶底物（Ala-MCA 和Met-MCA）不分解。丝氨酸类蛋白酶抑制剂对该酶具有强烈抑制作用。本研究结果可为白姑鱼内源性水解酶的应用、白姑鱼的贮存和加工工艺的改善提供依据。

参考文献：

［1］ SAPPASITH K， SOOTTAWAT B， WONNOP V， et al.Trypsin from the pyloric caeca of bluefish （Pomatomus saltatrix）［J］.Comparative Biochemistry and Physiology: Part B， 2007， 148（4）: 382-389.DOI:10.1016/j.cbpb.2007.07.004.

［2］ SAPPASITH K， SOOTTAWAT B， WONNOP V， et al.Trypsins from yellowfin tuna （Thunnus albacores） spleen: purification and characterization［J］.Comparative Biochemistry and Physiology: Part B，2006， 144（1）: 47-56.DOI:10.1016/j.cbpb.2006.01.006.

［3］ SAPPASITH K， SOOTTAWAT B， WONNOP V， et al.Purification and characterization of trypsin from the spleen of Tongol Tuna （Thunnus tonggol）［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006， 54（15）: 5617-5622.DOI:10.1021/jf060699d.

［4］ LIU C H， SHIU Y L， HSU J L.Purification and characterization of trypsin from the pyloric ceca of orange-spotted grouper， Epinephelus coioides［J］.Fish Physiology and Biochemistry， 2012， 38（3）: 837-848.DOI:10.1007/s10695-011-9571-3.

［5］ LU B J， ZHOU L G， CAI Q F， et al.Purification and characterisation of trypsins from the pyloric caeca of mandarin fish （Siniperca chuatsi）［J］.Food Chemistry， 2008， 110（2）: 352-360.DOI:10.1016/ j.foodchem.2008.02.010.

［6］ 吕英涛， 康从民， 王琳， 等.鳀鱼胰蛋白酶分离纯化及性质初步研究［J］.食品科学， 2010， 31（1）: 181-184.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201001042.

［7］ 叶丽芳， 励建荣.海洋鱼虾中内源蛋白酶的研究状况［C］.绍兴， 浙江: 食品安全监督与法制建设国际研讨会暨第二届中国食品研究生论坛.杭州， 2005-11-12.

［8］ DELBARRE-LADRAT C， CHRERT R， TSYLOR R， et al.Trends in postmortem aging in fish: understanding of proteolysis and disorganisation of the myofibrillar structure［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2006， 46（5）: 409-421.DOI:10.1080/10408390591000929.

［9］ ERLANGER B， KOKOWSKY N， COHEN W.The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics， 1961， 95（2）: 271-278.DOI:10.1016/0003-9861（61）90145-X.

［10］ ALI B， NABIL S， NAHED F.Purification and characterization of trypsin from the viscera of sardine （Sardina pilchardus）［J］.Food Chemistry， 2007， 102（1）: 343-350.DOI:10.1016/ j.foodchem.2006.05.050.

［11］ 陈荣昌， 杜泓璇， 马尧， 等.青鱼胰蛋白酶的分离纯化及部分性质研究［J］.安徽农业科学， 2008， 36（11）: 4541-4543.DOI:10.3969/ j.issn.0517-6611.2008.11.074.

［12］ 胡重江.草鱼胰蛋白酶的纯化及部分性质研究［D］.重庆: 西南农业大学， 2005.

［13］ 耿莉娜， 胡重江， 李英文.草鱼肝胰脏中两种胰蛋白酶的纯化及部分性质的研究［J］.重庆师范大学学报（自然科学版）， 2008， 25（1）: 14-19.DOI:10.11721/cqnuj20080104.

［14］ ASGEIRSSON B， FOX J W， BJARNASON J B.Purification and characterization of trypsin from the poikilotherm Gadus morhua［J］.European Journal of Biochemistry， 1989， 180（1）: 85-94.DOI:10.1111/ j.1432-1033.1989.tb14618.x.

［15］ OSATAOMI K， SASAI H， CAO M J， et al.Purification and characterization of myofibril-bound serine proteinnase （MBSP） from Carp Cyprinus carpio ordinary muscle［J］.Comparative Biochemistry Physiology， 1997， 116（2）: 183-190.DOI:10.1016/S0305-0491（96）00208-8.

［16］ HEIDI O， GUNNAR I， AME O， et al.Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon （Salmon salar） in comparison with bovine and porcine trypsin［J］.Comparative Biochemistry and Physiology，1996， 115（1）: 33-45.DOI:10.1016/0305-0491（96）00081-8.

［17］ JELLOULI K， BOUGATEF A， DAASSI D， et al.New alkaline trypsin from the intestine of Grey triggerfish （Balistes capriscus） with high activity at low temperature: purification and characterization［J］.Food Chemistry， 2009， 116（3）: 644-650.DOI:10.1016/ j.foodchem.2009.02.087.

［18］ SIMPSON B K， HAARD N F.Trypsin from Greenland cod， Gadus ogac.Isolation and comparative properties［J］.Comparative Biochemistry and Physiology， 1984， 79（4）: 613-612.DOI:10.1016/0305-0491（84）90375-4.

［19］ KLOMKLAO S， BENJAKUL S， VISESSANGUAN W， et al.29 kDa trypsin from the pyloric ceca of Atlantic bonito （Sarda）: recovery and characterization［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2007，55（11）: 4548-4553.DOI:10.1021/jf063319x.

［20］ FRANCISCO J C， RAMON P A， MARIA E L， et al.Biochemical characterization of an isoform of chymotrypsin from the viscera of Monterey sardine （Sardinops sagax caerulea）， and comparison with bovine chymotrypsin［J］.Food Chemistry， 2009， 112（3）: 634-639.DOI:10.1016/j.foodchem.2008.06.023.

［21］ MARTHINEZ A， OLSEN R L， SERRA J L.Purification and characterization of two trypsin-like enzymes from the digestive tract of anchovy Engraulis encrasicholus［J］.Comparative Biochemistry and Physiology， 1988， 91（4）: 677-684.DOI:10.1046/j.1444-2906.2000.00185.x.

［22］ UNAJAK S， MEESAWAT P， PAEMANEE A， et al.Characterisation of thermostable trypsin and determination of trypsin isozymes from inyestine of Nile tilapia（Oreochromis mossambicus L.）［J］.Food Chemistry， 2012， 134（3）: 1533-1541.DOI:10.1016/ j.foodchem.2012.03.074.

［23］ LIU Z Y， WANG Z， XU S Y， et al.Two trypsin isoforms from the intestine of the grass carp （Ctenopharyngodon idellus）［J］.Journal of Comparative Physiology B， 2007， 177（6）: 655-666.DOI:10.1007/ s00360-007-0163-6.

［24］ CAO M J， OSATAOMI K， HARA K， et al.Identification of a myofibrilbound serine proteinase （MBSP） in the skeletal muscle of lizard fish Saurida wanieso which specifically cleaves the arginine site［J］.Comparative Biochemistry and Physiology， 2000， 125（2）: 255-264.

［25］ MARIA A， FEMANDO L， PATRICIA H C， et al.Biochemical characterisation of chymotrypsin from the midgut gland of yellowleg shrimp， Penaeus californiensis［J］.Food Chemistry， 2015， 173: 147-155.DOI:10.1016/j.foodchem.2014.09.160.

［26］ RAFIK B， FATEH B， ALI B， et al.Chymotrypsin from the hepatopancreas of cuttlefish （Sepia officinalis） with high activity in the hydrolysis of long chain peptide substrates: purification and biochemical characterization［J］.Food Chemistry， 2012， 130（3）: 475-484.DOI:10.1016/j.foodchem.2011.07.019.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613030

中图分类号：TS264.2

文献标志码：A

文章编号：1002-6630（2016）13-0168-05

收稿日期：2015-08-23

基金项目：厦门市海洋渔业局（南方海洋中心）项目（14CZP03HJ04）；福建省科技厅引导性项目（2016N0020）

作者简介：李欢（1989—），男，硕士研究生，研究方向为食品科学。E-mail：18030221708@163.com

*通信作者：杜翠红（1967—），女，教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：cuihongdu@jmu.edu.cn

Purification and Characterization of Trypsin from White Croaker （Argyrosomus argentatus）

LI Huan， LI Ting， ZHAN Yunchao， DU Cuihong*
（National & Local Joint Engineering Research Center of Processing Techonology for Aquatic Products， College of Food and Biological Engineering， Jimei University， Xiamen 361021， China）

Abstract:An anionic trypsin （named as trypsin A） from the pyloric caeca of white croaker （Argyrosomus argentatus） was purified by ammonium precipitation， DEAE-Sepharose Fast Flow anion exchange chromatography and Sephacryl S-200 gel filtration chromatography.The characteristics of trypsin A were investigated.The results showed that trypsin A migrated as a single protein band with a molecular weight of about 28 kD in SDS-PAGE.Trypsin A exhibited its optimal temperature at 50 ℃ and was stable below 65 ℃.Trypsin A revealed its optimal pH at 9.5 and was stable in the pH range from 9.5 to 11.0.The purified trypsin A was analyzed by western blotting using anti-common carp trypsin antibody， and the result showed that the active region of the trypsin was highly conservative.Serine proteinase inhibitors were effective against trypsin A.

Key words:white croaker； trypsin； separation and purification； enzymatic characteristics