2株西玛津降解菌的降解特性研究

任兵，张金艳，李绍峰

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆163319；2.深圳职业技术学院深圳市工业节水及城市污水资源化技术重点实验室）

2株西玛津降解菌的降解特性研究

任兵1，2，张金艳1，李绍峰2

（1.黑龙江八一农垦大学，大庆163319；2.深圳职业技术学院深圳市工业节水及城市污水资源化技术重点实验室）

利用2株降解细菌S-1和S-3对西玛津进行生物降解，研究其降解能力及降解特性。通过紫外可见分光光度法测定OD600考察S-1和S-3的生物学特性，高效液相色谱法检测不同条件下两菌对西玛津降解效果的影响以及混合菌的降解效果。结果表明：在30℃，pH 7.5条件下培养72 h后，0.2 mg·L-1西玛津降解率均可达到99%以上；两菌对中低浓度底物（0.2～10.0 mg·L-1）的降解效果较好，72 h几乎降解完全，高浓度（25.0～50.0 mg·L-1）则不利于降解，50.0 mg·L-1时S-1和S-3最高降解率分别为56.67%和75.53%，外加少量碳源和氮源后降解速率均有所提高；混合菌的最佳配比为1∶1，此时西玛津降解率最高，混菌的降解速率及降解能力均强于单菌，可见S-1和S-3对西玛津均具有较强的降解能力，说明两株降解菌在残留西玛津污染治理中具有独特的应用前景。

西玛津；生物降解；高效液相色谱；混合菌

西玛津（Simazine）化学名为2-氯-4，6-二（乙胺基）-1，3，5-三嗪，自1995年起便作为一种高效除草剂使用，主要用于控制多种作物田内的阔叶杂草［1］，但由于其具有非常稳定的分子结构，在环境中不断地积累，加之其内分泌干扰作用及致癌活性对生态环境和人类健康均存在潜在的威胁［2-3］，在许多国家的检出率均已超出法定限制（>1 μg·L-1）［4］。面临污染常规的处理工艺未能取得较好成效，然而利用环境微生物进行降解却有较强的去除能力，且无二次污染。目前研究者发现可以降解西玛津的微生物有很多，细菌主要有假单胞菌属（Pseudomonas）［5］、节细菌属（Arthrobacter）［6］等；真菌主要包括青霉菌（Pinicielium）［7］、曲霉菌（Aspergillus）［8］和木霉菌（Trichoderma）［9］等，其中假单胞菌属的微生物代谢活性相对较高，可降解多种有机污染物，对三嗪类除草剂西玛津具有较强的降解能力［10］。

研究利用2株高效降解细菌S-1和S-3降解西玛津，对单菌降解能力和降解特性进行考察，并对混合菌降解西玛津时两菌之间的相互作用进行阐明，目前已有研究证明，两种以上微生物联合作用可以提高降解效果［11］，但也可对降解过程产生抑制［12］，因此对混合菌的研究在理论和实践上都有重要的意义。

1 材料和方法

1.1 试验菌株

2株降解菌均由本课题组前期驯化筛选获得，一株是假单胞菌（Pseudomonas sp.），另一株是嗜麦芽寡氧单胞菌（Stenotrophomnas maltophilia sp.），生理生化特性见文献［13-14］，分别用S-1和S-3表示。

1.2 培养基和试剂

LB培养基：1L水中含蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母粉5 g，pH 7.5，121℃高压灭菌20 min。

西玛津降解培养基：1 L水中含Na2HPO4·H2O 0.07 g，KH2PO40.01 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，葡萄糖0.1 g，添加一定浓度西玛津保证终浓度为0.2 mg·L-1，pH 7.5，115℃高压灭菌30 min。

西玛津（纯度≥98%），购于sigma公司，乙腈（色谱纯）进口，其他试剂（分析纯），购于广州化学试剂二厂、天津市大茂化学试剂厂及广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 试验仪器

高效液相色谱仪（Waters-2695e）-2998紫外检测器（美国Waters公司）；UV-7504紫外可见分光光度计（上海欣茂仪器公司）；HVE-50高压灭菌锅（日本Hirayama公司）；HZQ-FX恒温振荡培养箱（东联电子技术开发公司）。

1.4 方法

1.4.1 菌悬液的制备

式中：R为西玛津生物降解率；C0为接种前培养液中西玛津浓度（mg·L-1）；C为降解后西玛津浓度（mg·L-1）。

1.4.4 菌株的生长及对西玛津的降解

将S-1和S-3菌悬液按2%的接种量分别接入50 mL西玛津降解培养基中，30℃、150 r·min-1条件下振荡培养，在不同时间段取样，取不接菌的空白对照，每个处理设3个重复，测定600 nm波长下的吸光度值OD600，采用HPLC测定培养液中西玛津含量，明确两菌株的生长和降解趋势。

1.4.5 降解影响因素考察

设定不同培养温度、pH、底物浓度、外加普通碳源和氮源及不同金属离子，培养条件及检测方法同（1.4.3），考察不同因素对S-1和S-3生长及对西玛津降解率的影响，每个处理设3个重复。

1.4.6 两菌最佳配比及降解效果研究

将S-1和S-3按照体积比为8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4和1∶8的比例分别接种于西玛津降解培养基中，摇床培养72 h，培养条件同（1.4.3），设不接种的空白对照，考察混合菌降解西玛津的最佳配比，另将最佳配比下混菌的降解效果与单菌降解效果进行对比研究。

将于LB液体培养基中培养12～24 h的菌液以12 000 r·min-1离心5 min，弃上清液，加入适量无菌水反复洗涤、离心3次，然后用无菌水稀释下层菌体，得到菌密度OD600≈1.0的菌悬液。

1.4.2 菌体生长量测定

采用紫外可见分光光度法［15］测定菌液在600 nm处的光密度（OD600）来表示菌株的生长量变化情况。

1.4.3 西玛津浓度测定

采用液相色谱法［16-18］测定降解液中西玛津的含量变化，色谱柱型号4.6 mm×250 mm，5 μm反向C18柱，检测波长为222 nm，流动相乙腈：水（体积比）= 60∶40，进样量为10 μL，流速为1 mL·min-1，检测时间10 min。降解率计算见公式（1）

2 结果与分析

2.1 菌株S-1和S-3的生长及对西玛津的降解能力

微生物生长一般可分为四个阶段：适应期、对数期、延滞期和衰亡期，本节对S-1和S-3的生长及对西玛津的降解情况进行了研究，结果如图1所示。

图1 S-1和S-3的生长及西玛津降解曲线Fig.1 The curves of the growth and simazine degradation of S-1 and S-3 strains

由图1可见，S-1和S-3的生长及对西玛津的降解情况存在一定关联性，生长曲线表明，除生长速率快慢不同外，两菌的生长情况相似，S-1在0～12 h生长缓慢，应处于适应期，12 h后进入对数生长期，36 h后生长速率减缓，开始进入延滞期，OD600最大达到0.923；S-3在0～8 h处于适应期，之后进入对数期，24 h后生长速率减慢，最大生长量OD600可达到0.959，菌株S-3的生长速率比S-1快。降解曲线可见，降解速率与生长速率类似，菌株S-3大于S-1，S-3在24 h时近乎将西玛津降解完全，S-1在36 h才能达到S-3的降解水平，但培养72 h后最终降解率均可达99%以上，说明两株降解菌对西玛津均具有较强的降解能力。

图2 温度对S-1和S-3生长及西玛津降解率的影响Fig.2 Effects of temperature on S-1 and S-3 growth and simazine degradation

2.2 菌株S-1和S-3降解西玛津的基本特性

2.2.1 温度对降解效果的影响

温度对细菌生长影响较大，本试验分别考察S-1和S-3在不同温度下的适应性，温度设定为15、20、25、30、35、40℃，培养72 h后测定两菌的生长和对西玛津的降解情况，结果如图2所示。

图2可见，当温度在15～40℃之间变化时，S-1和S-3的生长及对西玛津的降解均有很大变化，开始时随着温度升高，两菌的生长量和西玛津降解率均随之增加，30℃时峰值均达到最大，OD600分别为1.169和1.237，降解率均可达99.5%以上，温度继续升高，两菌生长量和西玛津降解率均呈现降低趋势，可能因为温度的变化引起了细菌体内酶活性的变化［19］，最终确定两菌的最适温度为30℃，温度过高不利于降解。

2.2.2 pH对降解效果的影响

随微生物种类的不同其最适生长pH也不同，pH将直接影响着微生物的生长代谢，试验考察了两菌对不同pH的适应性，pH设定为5、6、7、8、9、10，培养72 h后测定结果见图3所示。

图3 pH对S-1和S-3生长及西玛津降解率的影响Fig.3 Effects of pH on S-1 and S-3 growth and simazine degradation

图3可见，当pH在7.0～9.0之间时，S-1和S-3的生长情况以及对西玛津的降解效果均较好，pH为7.0和8.0时降解率相差不大，其中S-1在偏酸性条件下降解能力强于S-3，在偏碱性条件下降解能力弱于S-3，且S-3对pH的适应能力强于S-1，综合考虑，故将pH定为7.5。

2.2.3 初始底物浓度对降解效果的影响

在最适条件下，设定西玛津浓度分别为0.2、2.0、5.0、10.0、25.0 mg·L-1和50.0 mg·L-1，考察了不同初始底物浓度对S-1和S-3降解西玛津效果的影响，结果如图4所示。

图4 S-1（a）和S-3（b）对不同底物浓度西玛津的降解情况Fig.4 Biodegradation of the different simazine substrate concentrations of S-1（a）and S-3（b）

可见，中低等浓度（10.0 mg·L-1以下）西玛津降解72 h后，S-1和S-3几乎将其完全降解，当培养液中底物浓度增加至25.0 mg·L-1以上时，两株降解菌的降解效率明显降低，25.0 mg·L-1时S-1和S-3的最高降解率分别为75.12%和82.25%，50.0 mg·L-1时最高降解率分别为56.67%和75.53%，可见浓度升高降解率呈现降低的趋势，说明高浓度底物不利于降解。

2.2.4 外加碳源和氮源对降解效果的影响

碳源和氮源对微生物的生长繁殖有重要的作用，研究选用实验室中几种较常见的含碳、氮化合物作为外加碳源和氮源，并设置不加碳源、氮源及不接种的对照组，在最适条件下摇床振荡培养72 h，定期取样测定西玛津降解率变化情况，结果如图5所示。

图5 不同碳源和氮源对S-1（a）和S-3（b）降解效果的影响Fig.5 Effects of the different carbon and nitrogen sources on the degradation of simazine by S-1（a）and S-3（b）

图5（a和b）可见，菌株S-1和S-3在添加少量碳源和氮源条件下西玛津的降解速率均有所提高，且提高效果差别较大，外加碳源S-1降解速率提高效果由快到慢分别为葡萄糖＞乳糖＞果糖＞蔗糖＞柠檬酸钠，S-3顺序为葡萄糖＞果糖＞乳糖＞蔗糖＞柠檬酸钠，外加氮源S-1降解速率提高效果由快到慢分别为牛肉浸膏＞酵母粉＞蛋白胨＞硝酸铵＞尿素，S-3顺序为牛肉浸膏＞酵母粉＞蛋白胨＞尿素＞硝酸铵，其中外加碳源和氮源对S-1降解影响均较明显，但对S-3而言，外加碳源对西玛津降解产生的影响明显大于外加氮源，分析表明，两菌株生长及降解西玛津的最适碳源为葡萄糖，最适氮源为牛肉浸膏。由于试验后期要对降解机理进行研究，可能涉及到降解体系中氮的转化，因此试验培养基中不添加任何氮源。

2.2.5 金属离子对降解效果的影响

金属离子对微生物的生长、代谢产物的合成及细胞的生命活动都有一定影响，在最适条件下，添加浓度均为1 mmol·L-1的不同金属离子，培养72 h后测定结果见图6所示。

图6 金属离子对S-1和S-3降解西玛津的影响Fig.6 Effects of metal ions on the degradation of simazine by S-1 and S-3

图6可见，培养液中添加少量的金属离子对S-1和S-3降解西玛津存在一定影响，其中与对照组相比，其中Zn2+、Ca2+、Mg2+离子对S-1降解西玛津产生了促进作用，使降解率分别提高了3.1%、7.2%和2.2%，Fe3+离子几乎无影响，而Cu2+、Ba2+、Cr3+、As5+、Co2+、Ni2+离子对S-1降解西玛津产生了抑制作用，其中Cu2+、Cr3+、Co2+三种离子的抑制作用非常明显，抑制率分别可达51.0%、54.7%，Zn2+、Mg2+离子对S-3降解西玛津具有促进作用，使得降解率分别提高了3.6%和3.3%，Fe3+和Ca2+离子影响较小，可忽略不计，剩余离子对S-3降解西玛津过程均有较强的抑制作用，其中Cu2+抑制作用最明显，抑制程度达到69.8%。

2.3 混合菌降解效果

以西玛津降解率为评价指标，通过实验测得S-1和S-3的不同配比对降解效果有一定影响，结果如图7所示，另外考察了最佳配比下两菌混合的降解效果，并与单菌进行比较，结果如图8所示。

图7可见，当VS-1∶VS-3在2∶1～1∶4之间时，西玛津降解率均可以达到90%以上，其中配比为1∶1时降解率达到最大值99.6%，说明两菌混合的最佳配比为1∶1。如图8可见，在最佳配比条件下，混合菌的降解能力略大于S-3，远大于S-1，说明在混合菌的降解过程中S-3的作用占主导地位，S-1作为辅助菌，另外两菌混合后提高了西玛津的降解速率，可见S-1和S-3混合降解存在一定互生关系，相互促进。

图7 不同配比对降解效果的影响Fig.7 Effect of the different proportions on the degradation

图8 对比实验结果Fig.8 Comparison experiment results

3 结论

试验菌株S-1和S-3对西玛津都具有较强的降解能力，且S-3强于S-1，其中S-3摇床培养24 h几乎可将0.2 mg·L-1的西玛津降解完全，S-1要36 h才能达到同等水平，两菌株对温度的适应性不强，最适温度为30℃，高于或低于30℃，菌株的生长量和对西玛津的降解率均明显降低，可能因为温度控制着细菌体内酶活性的变化［19］。菌株对培养液酸碱度的适应能力相对较强，在pH 7.0～9.0之间时，两菌株的生长和降解情况较好，其中S-1在偏酸性条件下的降解能力优于S-3，而在偏碱性条件下恰恰相反，但过高或过低均会对细菌体内酶的诱导活性产生一定影响。

S-1和S-3对相对高浓度西玛津的耐受能力较差，当浓度大于25 mg·L-1后降解明显受到抑制，降解率随着底物浓度的增加而降低，与杜彦玲等［20］的研究结果相符，添加普通碳源和氮源后对最终降解率影响不大，只加快了降解菌的降解速率，该结果与刘爱菊［21］的结论相一致。另外发现不同的金属离子对降解作用也有一定影响，Cu2+和Cr3+对降解过程有明显的抑制作用，Zn2+和Mg2+具有一定促进作用。

目前为止，对于残留农药应用混合菌的降解研究也已频繁报道，其中有很多可以促进微生物的降解，也有些对降解过程产生了抑制［12，22］，研究混合菌的降解能力强于单菌，促进了西玛津的降解，存在一种互生关系。因此，研究结果可为环境中西玛津残留污染的生物修复提供新思路。

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Degradation Characteristics of Two Simazine-degrading Bacterial Strains

Ren Bing1，2，Zhang Jinyan1，Li Shaofeng2
（1.Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Shenzhen Polytechnic，Shenzhen Key Laboratory of Industrial Water Saving and Municipal SewageReclamation Technology）

Two degradation bacterial strains S-1 and S-3 were used to biodegrade simazine to study their degradation capability and characteristics.The optical density OD600 was determined by Vis-UV Spectrophotometry to study biological characteristics of S-1 and S-3，the effects of different conditions on the simazine degradation was researched by HPLC and the degradation efficiency of mixed bacterias for simazine.The results showed that the degradation rate of 0.2 mg·L-1simazine reached 99%within 72 h under the condition of 30℃，pH 7.5；The lower-middle concentrations（0.2-10.0 mg·L-1）were degraded completely and high concentrations（25.0-50.0 mg·L-1）were not conducive to degrade within 72h by S-1 and S-3，the maximum degradation rate of S-1 and S-3 were 56.67%and 75.53%respectively，when the concentration was 50.0 mg·L-1.The degradation efficiency was improved by adding a small amount of carbon source and nitrogen source.The degradation rate of simazine reached the highest when the ratio was 1∶1，the degradation rate and ability was better than single bacterium.S-1 and S-3 had stronger degradation capacity，which illustrated they had special application potential in dealing with the pollution caused by simazine.

simazine；biodegradation；HPLC；mixed bacterias

S482.4

A

1002-2090（2016）03-0099-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.03.020

2015-04-15

广东省自然科学基金（S2012040007855）。

任兵（1989-），男，黑龙江八一农垦大学农学院2013级农药学硕士研究生。

张金艳，女，教授，硕士研究生导师，E-mail：nyxsh086@163.com。