口蹄疫病毒诱导PK-15细胞发生自噬的研究

范许许， 郜 原， 郭慧琛， 孙世琪

(中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，国家口蹄疫参考实验室，甘肃兰州 730046)



口蹄疫病毒诱导PK-15细胞发生自噬的研究

范许许， 郜 原， 郭慧琛， 孙世琪*

(中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，国家口蹄疫参考实验室，甘肃兰州 730046)

摘要[目的] 探究Asia1型口蹄疫病毒感染PK-15细胞后能否诱导自噬的发生，分析细胞自噬对口蹄疫病毒复制的影响。[方法] 用未经处理的PK-15细胞和自噬抑制剂3-MA处理的PK-15细胞分别感染口蹄疫病毒，通过蛋白免疫印迹和共聚焦激光显微镜检测自噬的诱导情况。[结果] 自噬标志分子LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白水平的比值增加，并且LC3特异的绿色荧光聚集；自噬抑制剂3-MA处理细胞后口蹄疫病毒复制水平显著上调。[结论] Asia1型口蹄疫病毒感染PK-15细胞后能够诱导发生自噬，而自噬又促进口蹄疫病毒的复制。

关键词口蹄疫病毒；自噬；LC3

口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)隶属小RNA病毒科口蹄疫病毒属，因其感染偶蹄动物后引起发病动物口腔黏膜、四肢末端和乳房等处出现病理性水泡变化而得名。该病一旦暴发将会对畜牧业和肉产品市场造成不可估量的经济损失。口蹄疫病毒有7个血清型(O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3)，每个血清型均具有广泛的抗原变异特性，不能形成交叉免疫保护，从而极大地增加了该疫病防控的难度[1]。历史上该疫病的数次大暴发造成了巨大的经济损失，因此研究口蹄疫病毒的致病机理及其有效防控措施已迫在眉睫[2]。

自噬(Autophagy)是最早发现的一种自食现象，是指真核细胞内来自粗面内质网的没有核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需要降解的细胞器、长寿命蛋白质等成分形成自噬体(Autophagosome)，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，可以简单理解为是依赖溶酶体的细胞内降解过程。目前已经发现的自噬基因有30多种，共同参与调控自噬的起始、延伸、闭合和降解这4个过程[3-4]。自噬的生理意义是在细胞受到应激性的死亡威胁时保持细胞的存活，是真核细胞维持稳态与实现更新的一种重要的保守机制。最新的研究发现自噬与许多疾病的发生密切相关，如癌症、神经退行性疾病、肝功能紊乱、心力衰竭、传染性疾病、炎症性疾病、糖尿病及肥胖症等[5-7]。

在小RNA病毒科脊髓灰质炎病毒的研究中发现，细胞自噬促进该病毒的复制，因而有人推测自噬可能同样有利于口蹄疫病毒在宿主细胞内的复制。GLADUEDP等[8]用自噬诱导剂——雷帕霉素处理细胞，促进病毒的复制，用3-MA处理抑制病毒的复制。然而，Berryman等[9]自噬抑制剂处理细胞，对病毒的复制却没有影响。研究表明，口蹄疫病毒激活的细胞自噬与其他小RNA病毒有明显差异，在其他小RNA病毒上发现的自噬特征并没有出现在口蹄疫病毒上，主要体现在能否利用自噬体膜方面。脊髓灰质炎病毒、库克萨基病毒都可以利用自噬体膜促进自身复制，但口蹄疫病毒诱导产生的自噬体并不能给病毒复制提供膜结构，但其作用机理目前尚不清楚[9-11]。笔者用未经处理的PK-15细胞和自噬抑制剂3-MA处理的PK-15细胞分别感染口蹄疫病毒，通过蛋白免疫印迹和共聚焦激光显微镜检测自噬的诱导情况。

1材料与方法

1.1材料口蹄疫病毒毒株Asia1/Jiangsu/China/2005(GeneBankAccessionNo.EF149009)，由国家口蹄疫参考实验室保存；幼仓鼠肾传代细胞(BHK-21)、猪肾传代细胞(PK-15)由家畜疫病病原生物学国家重点实验室保存；兔抗LC3、小鼠抗ATG5-ATG12单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、TRITC标记的兔抗猪IgG和FITC标记的山羊抗兔IgG，均购自Sigma公司；小鼠抗β-actin单克隆抗体，购自SantaCruz公司。

细胞培养用PBS、DMEM、0.25%-EDTA胰酶、青霉素和链霉素，均购自Gibco公司；胎牛血清、3-MA和多聚甲醛，均购自Sigma公司；蛋白预染Marker，购自全式金公司；ECL底物发光试剂盒，购自Thermo公司；蛋白酶抑制剂，购自Invitrogen公司；硝酸纤维素膜，购自Pall公司；DAPI购自碧云天公司。

1.2方法

1.2.1病毒的处理。

1.2.1.1病毒的传代。将Asia1/Jiangsu/China/2005(GenBank登录号EF149009)FMDV病毒株感染BHK-21单层细胞进行传代，待细胞完全病变脱落后贮存于-70 ℃冰箱中，使用前反复冻融3次后，0.22μm滤膜过滤，分装并保存。

1.2.1.2病毒滴度的测定。用含5%胎牛血清的DMEM悬浮BHK-21，取悬液分别接种于96微孔板，每孔50μL，每个孔的细胞密度约为1.5×106cells/mL，在细胞培养箱中培养24h后，依次加入用无血清DMEM倍比稀释的病毒液，每个稀释比例添加在8个孔内，培养60h后在普通光学显微镜下观察细胞病变，并根据Reed-Muench方法计算出病毒的TCID50。

1.2.1.3病毒感染。培养的单层PK-15，加入感染复数(Multiplicityofinfection，MOI)为1或25的FMDV原液，4 ℃下孵育1h后，弃去毒液，并用冷PBS清洗掉未结合的病毒，然后加入含2%胎牛血清的DMEM维持液于37 ℃细胞培养箱中继续培养，不添加病毒液的细胞为对照。在感染的不同时间段1～3h，加入4%多聚甲醛固定细胞，然后进行间接免疫荧光试验，以共聚焦激光扫描显微镜进行观察。此外，收集感染不同时间点的细胞，用于Westernblot分析。

1.2.2蛋白免疫印迹(Westernblot)。待收取的细胞弃掉培养基，用冷的PBS漂洗2次，加入1mL冷的PBS，将细胞刮下后将细胞悬液移入离心管中，4 ℃ 1 000r/min离心5min。轻轻弃上清，加入300μL改良的RIPA裂解缓冲液，振荡充分混匀后，冰上静置30min，每隔5min振荡1次。然后，4 ℃下 10 000r/min离心5min，收取上清，加入适量的5×SDS缓冲液，混匀后在金属浴100 ℃煮样10min。SDS-PAGE凝胶的配制参照《分子生物学实验指南》，然后进行SDS-PAGE电泳，每个泳道蛋白样品上样量为30μg，同时单独选泳道加入预染蛋白Marker作为指示。蛋白样品在上层浓缩胶中，设置电压为80V；待蛋白样品进入下层分离胶后，调节电压至120V，直至电泳结束。转印前，根据SDS-PAGE凝胶的大小剪取适当大小(约为5.0cm×7.5cm)硝酸纤维素膜(NC膜)，与滤纸一同在转印缓冲液中浸泡，按照“膜正胶负”顺序放置蛋白胶，如同一个“夹心三明治”的结构：负极-海绵-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-海绵-正极，应严格控制放置过程中不能出现气泡，夹好后将其放置到湿转转印槽内，加入足够多预冷的转印缓冲液，接通电源，设置参数(恒流200mA转印2h)，转印槽外部用冰辅助降温。待转印结束后，用封闭液室温封闭NC膜1h，加入TBST稀释的一抗，室温孵育1h或者4 ℃轻摇振荡过夜，TBST漂洗3次后，加入TBST稀释的二抗，室温轻摇1h，TBST漂洗3次后，进行显色反应。

1.2.3激光共聚焦扫描显微镜观察。4%多聚甲醛固定细胞10min，PBS洗2次；0.1%TritonX-100通透细胞膜5min，PBS洗2次；用5%NBS封闭20min；加入1%NBS稀释的一抗(1∶100)37 ℃孵育1h，PBST洗2次；分别加入FITC和TRITC标记的IgG稀释液，37 ℃孵育1h，PBST洗2次；加入DAPI稀释液，室温孵育5min，PBS洗2次；利用激光共聚焦扫描显微镜观察自噬的诱导作用。

2结果与分析

2.1FMDV感染PK-15细胞后激活LC3和ATG5-ATG12LC3是检测自噬发生的标志性分子，LC3有2种形式，其中LC3-Ⅰ弥散地分布在胞质中，一旦自噬发生，LC3-Ⅰ就会转变为LC3-Ⅱ并且特异地结合在自噬泡的内外膜上。利用Westernblot检测LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值的变化，是判断自噬发生的经典途径。此外，ATG5-ATG12复合体诱导自噬体膜的弯曲延伸，该复合体蛋白水平的变化也可作为检测自噬是否被激活的有力证据。研究表明，O型FMDV在人的癌细胞上激活自噬，并且发生在感染的初期阶段，即感染后3h内。笔者用MOI=1的Asia1型FMDV感染PK-15细胞，收集感染不同时间点的细胞样品进行Westernblot检测，使用灰度分析软件ImageJ对LC3和ATG5-ATG12的条带进行灰度分析，发现与对照相比，在病毒感染后30min即可检测到LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加，在感染后1hLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值达到最高峰，随后出现下降的趋势(图1)，说明FMDV激活宿主细胞发生自噬，且在3h内完成整个过程。此外，ATG5-ATG12复合体的变化与LC3-Ⅱ/LC3-I的变化大致相同。

注：FMDV(MOI=1)感染PK-15细胞，分时间段收集感染细胞，Western blot检测LC3-Ⅱ和LC3-I蛋白水平的变化。Note: PK-15 cells were infected with FMDV(MOI=10), infection cells were collected at different time period, the protein level change of LC3-Ⅱ and LC3-I was detected by Western blot. 图1　FMDV感染PK-15细胞LC3和ATG5-ATG12的变化Fig.1　The change of LC3 and ATG5-ATG12 after the PK-15 cells infected with FMDV

2.2FMDV感染PK-15细胞后引起LC3聚集自噬发生的另一标志性现象也与LC3有关，通过荧光显微镜观察细胞内点状聚集的绿色荧光，即可判断细胞是否发生自噬。笔者用MOI=10的亚洲1型FMDV感染PK-15细胞，收集感染不同时间点的细胞样品进行间接免疫荧光试验，最后在共聚焦激光扫描显微镜下观察细胞荧光。从图2可以看出，与对照组相比，感染FMDV的细胞内出现绿色荧光的点状聚集，与Westernblot检测结果相符合，证实FMDV感染宿主细胞后能够激活自噬。

注：FMDV(MOI=10)感染 PK-15 细胞，进行间接免疫荧光试验，然后借助共聚焦激光显微镜(CLSM)观察LC3绿色荧光的点状聚集。绿色代表LC3，蓝色代表细胞核。Note: PK-15 cells were infected with FMDV(MOI=10), after indirect immunofluorescence, then the green LC3 puncta were observed by CLSM. Green presented LC3 and blue presented nucleus.图2　FMDV感染宿主细胞引起LC3的点状聚集Fig.2　The observation of LC3 puncta in PK-15 cells infected with FMDV

2.3自噬抑制剂3-MA处理细胞促进口蹄疫病毒的复制3-MA是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路的抑制剂，3型PI3K激活后促进3，4，5-三磷脂酰肌醇(PIP3)在脂质双层膜上的形成，启动自噬的发生。用3-MA处理PK-15细胞1h,然后感染口蹄疫病毒(MOI=1), 收集感染不同时间点的细胞样品进行Westernblot检测，发现3-MA处理过的PK-15细胞中口蹄疫病毒的复制水平显著上调(图3)，灰度分析结果如图4所示。

注：100 mmol/L的3-MA处理PK-15细胞1 h，感染FMDV(MOI=1)，分时间段收集感染细胞，Western blot检测口蹄疫病毒结构蛋白的变化。Note: PK-15 cells were processed with 3-MA(100 mmol/L) and were infected with FMDV(MOI=1), then they were collected at different time points, the change of FMDV structure protein was detected by Western blot. 图3　3-MA处理促进口蹄疫病毒在PK-15细胞内的复制Fig.3　The replication of FMDV in PK-15 cells promoted by 3-MA treatment

注：*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)。Note: * stands for significant difference(P<0.05); ** stands for extremely significant difference(P<0.01). 图4　灰度分析3-MA处理后口蹄疫病毒结构蛋白的表达水平Fig.4　Expression level of structural protein of FMDV after gray analysis of 3-MA treatment

3讨论

近年来，自噬研究已成为生命科学领域的热点，在很多病毒的研究中已经发现自噬与病毒感染宿主细胞密切相关，但是在口蹄疫病毒上关于自噬的研究还停留在初级阶段，这些研究表明口蹄疫病毒感染人的癌细胞系引起自噬的激活，但是激活的途径和方式尚不清楚。该研究以口蹄疫病毒的宿主细胞PK-15为研究对象，研究口蹄疫病毒在感染PK-15细胞后能否激活自噬作用。自噬抑制剂3-MA抑制PI3K通路从而抑制自噬，笔者发现在用3-MA处理细胞后，口蹄疫病毒的复制水平反而有所上升。研究发现，自噬的抑制剂3-MA并不抑制口蹄疫病毒激活的自噬，所以对病毒的复制没有任何影响，推测口蹄疫病毒激活的自噬不依赖于PI3K途径[9]。据报道，PI3K的另一个抑制剂渥曼青霉素处理BHK-21细胞后，可以促进病毒的复制[12]。这些争议的出现，很可能与口蹄疫病毒血清型种类的不同和细胞种属特异性有关。此外，也有学者认为口蹄疫病毒激活细胞自噬可能通过非经典自噬途径。因此，口蹄疫病毒感染细胞引起宿主细胞发生自噬的激活途径和自噬的类型仍然需要大量试验进行探究验证。

4结论

笔者以PK-15为研究对象,在口蹄疫病毒感染的PK-15细胞中检测自噬的激活。根据自噬发生的典型特征，即蛋白水平LC3-Ⅱ与LC3-I比值的升高和共聚焦激光显微镜下LC3荧光的聚集，验证了FMDV感染宿主细胞PK-15激活自噬，为了进一步探究自噬对口蹄疫病毒复制的影响，笔者用自噬的抑制剂3-MA处理PK-15细胞，检测到病毒复制的增强，说明自噬促进口蹄疫病毒的复制。总而言之，该研究证实了口蹄疫病毒激活宿主细胞PK-15发生自噬，并且3-MA处理的PK-15细胞能促进口蹄疫病毒的复制。

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基金项目国际科技合作专项(2014DFA31890)；国家科技支撑计划项目 (2013BAD12B00)。

作者简介范许许(1992- )，女，河南洛阳人，硕士研究生，研究方向：口蹄疫病毒分子病原学研究。*通讯作者，研究员，博士，硕士生导师，从事口蹄疫病毒分子致病机理研究和口蹄疫疫苗的研发。

收稿日期2016-05-06

中图分类号S 855.3

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)16-160-04

FootandMouthDiseaseVirusInducedAutophagyinPK-15Cells

FANXu-xu,GAOYuan,GUOHui-chen,SUNShi-qi*

(NationalFootandMouthDiseaseReferenceLaboratory,StateKeyLaboratoryofVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou,Gansu730046)

Abstract[Objective] To explore whether Asia1 type foot and mouth disease virus (FMDV) induces autophagy in PK-15 cells, and whether autophagy has effect on FMDV replication. [Method] PK-15 cells were infected with FMDV after treating with autophagy inhibitor 3-MA or not. The induction of autophagy was detected by western blot and confocal laser microscope. [Result] The ratio of autophagy marker LC3-Ⅱ and LC3-Ⅰ protein levels was up-regulated, and LC3 fluorescent gathered phenomenon was observed. Furthermore, the capside protein of FMDV increased in 3-MA treated cells. [Conclusion] FMDV induces autophagy in PK-15 cells, and the autophagy promotes the replication of FMDV.

Key wordsFoot and mouth disease virus; Autophagy; LC3