普洱茶茶褐素对大鼠肠道菌群的影响

岳随娟，刘建，龚加顺

普洱茶茶褐素对大鼠肠道菌群的影响

岳随娟，刘建，龚加顺*

云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201

摘要：本研究以普洱茶茶褐素（分子量＞50 kDa，TB）为研究对象，通过灌胃茶褐素后分析大鼠体内微生物变化，揭示普洱茶茶褐素对肠道菌群的影响。结果显示，茶褐素能显著改善抗生素的脱污染作用，调整肠道菌群失调，且具有促进大鼠肠道乳酸杆菌、双歧杆菌增殖，抑制大肠杆菌、肠球菌生长的作用，并随时间延长，效果愈加明显；而微生物的大量繁殖可加速茶褐素的分解代谢。

关键词：普洱茶茶褐素；肠道菌群；代谢；大鼠

GB/T 22111—2008中规定普洱茶的定义为：以地理标志保护范围内的云南大叶种晒青茶为原料，并在地理标志保护范围内采用特定的加工工艺制成，具有独特品质特征的茶叶。按其加工工艺及品质特征，普洱茶分为普洱茶（生茶）和普洱茶（熟茶）两种类型。云南大叶种晒青茶或普洱茶生茶在特定的环境下，经微生物、酶、湿热、氧化等综合作用，其内含物质发生一系列转化，形成普洱茶熟茶。普洱茶熟茶外形色泽红褐、内质汤色红浓明亮、香气独特陈香、滋味醇厚回甘、叶底红褐［1］。

随着普洱茶的不断升温，普洱茶的保健功能更多地被人们所认识，并得到了许多人的青睐。普洱茶的减肥、降脂、降血糖、防治心脑血管疾病、抗衰老、抗肿瘤、抗病菌、抗病毒等［2-3］多种保健功能及其作用机理研究主要针对普洱熟茶，且相关研究已开展了近20年。

普洱茶茶色素属于天然色素，指从普洱茶中提取的一类水溶性酚性色素。包括茶黄素（TF）、茶红素（TR）、茶褐素（TB）［4］。普洱茶在发酵过程中，多酚类、黄酮类、儿茶素、茶红素和水溶性寡糖均大幅下降，茶褐素显著增加［5］。普洱茶中茶褐素含量为8%～17%，具有类似红茶褐素的性质［6］。

近年来针对普洱茶茶褐素的报道日渐增多，目前公认的是茶褐素是一类分子差异极大的复杂的高聚合物，是不溶于氯仿、乙酸乙酯以及正丁醇的一类褐色色素，且茶褐素中含有相当数量的蛋白质、糖类、酸类物质（包括羧酸基以及酚羟基）［7］。

研究显示普洱茶茶褐素可显著降低高脂血症大鼠血清中总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）及低密度脂蛋白（LDL）水平，升高高密度脂蛋白（HDL）水平，并减少大鼠肝脏脂肪沉积，预防脂肪肝形成［8］。高斌等［9］报道普洱茶茶褐素可显著增强大鼠肝脏和附睾脂肪组织激素敏感性脂肪酶（Hormone-sensitive lipase， HSL）的活性及其mRNA的表达，具有明显的降血脂功效。以上研究提示茶褐素可能是普洱茶中重要的减肥、降脂成分。

随着社会的进步和经济的发展，人们生活节奏的加快和饮食结构的失调，肠道健康疾病成为一种普遍的“文明病”。根据肠道内寄生微生物对人体影响的效果可将其分为有益微生物和有害微生物。有益菌群和有害菌群构成人体肠道微生态动态平衡。国内外许多专家认为，患者饮食结构不合理导致肠道内微生态环境失衡，进而会引发一系列病态征状，如果要保持人体健康尤其是人体消化道的健康，必须特别重视人体肠道微生态的健康［10-11］。

茶叶中的有效成分对肠道易失调菌群有调节作用，在动物试验中发现［12］，给动物喂食茶多酚之后，粪便菌群中乳酸菌的水平有显著提高，且发现茶多酚在大肠内可选择性抑制某些杆菌，同时能促进双歧杆菌的生长，这种肠道内细菌微生态的平衡对肠道健康十分关键，可有效预防结肠癌等肠道疾病。

本文初步探讨了普洱茶茶褐素对肠道微生态平衡的影响。通过灌胃茶褐素后分析大鼠体内微生物变化，揭示普洱茶茶褐素对肠道菌群的影响，为进一步阐述普洱茶与人类健康的关系提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究材料、试剂与仪器

1.1.1 原料和试验动物

大益牌普洱茶熟茶，购自云南大益茶叶集团有限公司，唛号7512，批次111，生产日期：2011年 5月 18日。SD雄性大鼠，试验动物许可证：SYXKX（滇2011-0004），由昆明医科大学试验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂

无水乙醇、无水乙醚，分析纯，天津市化学试剂三厂；庆大霉素、磺苄青霉素、头孢霉素Ⅶ和两性霉素 B均是 USP，上海源叶生物科技有限公司；Pfizer肠球菌选择性琼脂、乳酸杆菌选择性琼脂、双歧杆菌BS培养基均是分析纯AR，青岛海博生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器

电子天平（BS210S）：北京赛多利斯天平有限公司；电子天平：感量为0.0001 g，沈阳龙腾电子有限公司；单人双面净化工作台（SW-CJ-1F）：苏州净化设备有限公司；培养箱（PGX）：宁波东南仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 TB的提取

普洱茶茶样→挑选清理→10倍蒸馏水浸提 2次→过滤→合并滤液→减压浓缩→乙醇醇沉（滤液和无水乙醇体积比为1∶4）→离心→收集沉淀→蒸馏水溶解→膜分离→收集分子量大于 50 kDa滤液→真空冷冻干燥→普洱茶茶褐素

1.2.2 试验动物的分组与饲喂管理

（1）试验动物的选择

选择健康成年雄性 SD大鼠，体质量160～200 g，外观符合健康标准即发育正常，无畸形，无外伤及皮肤无染物；体形丰满，头部端正，胸廓和背部良好及宽阔，臀部浑圆而匀称，四肢正常；眼部无分泌物，鼻无粘液流出，口腔无出血，耳无外伤；营养良好，饮食和两便正常，行动迅速，反应灵敏［13-14］。

（2）饲养方法及管理

大鼠在空调动物饲养室中同室群笼饲养，自由采食和饮水。每天换一次垫料、鼠笼，清洗饮水瓶。每天定时通风，记录动物饲养室温度和湿度，要求室温（20±2）℃，湿度45%～60%。每周测量摄食量、饮水量和体重、体长。

基础饲料由配方见表1。高脂饲料配方来源于卫生部2003年2月颁布的《保健食品检验与评价技术规范》［15］，配方见表2。基础饲料和高脂饲料均由昆明医科大学动物试验中心制作。

（3）试验动物组别设计

所有大鼠全部饲喂基础饲料，自由采食、饮水，喂养1周以适应环境和饲喂方式。1周后根据TC基础值水平，随机分为6组，每组15只大鼠，分别为正常对照组、TB+抗生素组、正常+TB组、高脂对照组、高脂+TB+抗生素组、高脂+TB组。其中 TB+抗生素组和高脂+TB+抗生素组在适应期于饮用水中加入抗生素，将正常微生物群全部或部分去除［16］，即脱污染，以进行肠道菌群失调造模。适应期结束后进入为期14 d的干预期，具体设计见表3。

表1 基础饲料配方Table 1 Basic food formula

表2 高脂饲料配方Table 2 High fat food formula

表3 试验大鼠组别设计Table 3 Group design of experimental rats

（4）茶褐素灌胃剂量

龚加顺等［17］研究表明，受试物的 LD50＞10 mg·kg-1（95%可信限），属实际无毒级物质。根据敬明武等［18］报道茶色素的人体推荐量为0.045 g·kg-1。按《保健食品评价程序和检验方法》的要求，设高、中、低3个剂量组，其中一个剂量组是人体可能摄入量的5～10倍，最高不超过30倍［15］。因此本试验中选择人体推荐量的27倍，即灌喂剂量1.215 g·kg-1。

（5）抗生素灌胃剂量

根据文献［19］的方法，将口服非吸收性抗菌素按下列比例混合于饮用水中，庆大霉素100 μg·mL-1、磺苄青霉素2 500 μg·mL-1、头孢霉素Ⅶ 2 500 μg·mL-1、两性霉素B 30 μg·mL-1。其中庆大霉素主要用于杀死革兰氏阴性肠道杆菌，磺苄青霉素和头孢霉素Ⅶ用于杀死革兰氏阳性肠道细菌，而两性霉素 B则用于杀死真菌。将这些作用机制不同的抗生素合并使用，即可增大杀菌作用，又可抑制耐药菌的出现。

1.2.3 待测盲肠内容物的制备及指标测定

（1）盲肠内容物采集

于7 d适应期结束后、干预期第7天、干预期第14天，乙醚麻醉大鼠，之后由试验人员按住大鼠的颈部，于无菌条件下，用手术刀将大鼠的腹部划开，取出盲肠内容物，置于无菌试管内。取大鼠盲肠内容物 0.3 g，置于装有玻璃珠的无菌小瓶内，加2.7 mL稀释液，于振荡器上震荡15 min，使内容物均质化。

（2）滴种及培养

将均质化样品稀释，双歧杆菌和乳酸杆菌稀释度选择10-6、10-7、10-8梯度，大肠杆菌和肠球菌稀释度选择10-5、10-6、10-7梯度。样品接种采用滴种法［20］，用移液枪吸取 75 μL，自高稀释度向低稀释度在相应的培养基上滴 3滴，每滴液体量约为25 μL。待液体滴种到相应菌种检测培养基后，将大肠杆菌EMB培养基、Pfizer肠球菌选择性琼脂放置37℃培养箱中，需氧培养24 h；乳酸杆菌选择性琼脂、双歧杆菌BS培养基置于37℃培养箱中，厌氧培养48～72 h。每个稀释度做3个平行板，经菌落辨别、革兰氏染色和镜检等初步鉴定后计数［21］。为避免肠道中厌氧菌长时间暴露于空气中，要求称重、稀释、接种至培养的全过程在30 min内完成。

（3）活菌计数

计算标本CFU值。选择菌落适中的稀释度，算出同一稀释度平均菌落数（X）。CFU=X×稀释倍数/标本质量，若表示为对数形式，将计算结果取对数。

2 结果与分析

2.1 适应期结束后大鼠肠道菌群的变化

尿液与血液中的物质变化，在一定程度上与肠道微生物密切相关。茶褐素为大分子物质，特别是含有多糖、蛋白质等，因此，肠道微生物对茶褐素的代谢可能有主要作用，值得探索。

脱污染是将正常微生物群全部或部分去除的措施。抗生素并不能将所有的菌群消灭，双歧杆菌还有部分存在。适应期结束后，结果如表4所示，与正常健康组相比，抗生素组大鼠的正常菌群急剧下降，其中大肠杆菌、肠球菌、乳酸杆菌在培养基中均无生长，双歧杆菌数量显著减少（P＜0.05），表明肠道菌群失调，肠道菌群失调模型已经建立。建模后，模型组大鼠粪便变稀，出现腹泻现象，肛门四周微红，盲肠肿大，肠壁变薄，盲肠内容物呈水状。

2.2 普通饲料组大鼠肠道菌群的变化

普通饲料组大鼠肠道菌群变化如表5。饲喂普通饲料7 d后，TB+抗生素组与适应期结束后抗生素组对比，所有主要菌群数量均大幅上升。TB+抗生素组与正常对照组对比，大肠杆菌、肠球菌的数量显著减少（P＜0.05）；乳酸杆菌与双歧杆菌的数量均显著增加（P＜0.05），表明茶褐素对抗生素脱污染大鼠肠道菌群失调有一定的恢复调整作用。正常+TB组与正常对照组相比，大肠杆菌与肠球菌的数量均显著降低（P＜0.05）；乳酸杆菌与双歧杆菌的数量均显著增加（P＜0.05），表明茶褐素具有增加正常大鼠肠道乳酸杆菌与双歧杆菌的作用，对大肠杆菌、肠球菌有抑制作用。正常+TB组与 TB+抗生素组相比，大肠杆菌与肠球菌数量显著降低（P＜0.05），乳酸杆菌与双歧杆菌的数量显著增加（P＜0.05），表明茶褐素在正常的大鼠肠道环境下能发挥更好的作用。

饲喂普通饲料14 d后，正常+TB组大肠杆菌与肠球菌的数量进一步减少，乳酸杆菌与双歧杆菌的数量进一步增加，大肠杆菌和肠球菌数量显著低于正常对照组（P＜0.05），乳酸杆菌和双歧杆菌数量显著高于正常对照组（P ＜0.05）。表明随着时间的延长，茶褐素对增加正常大鼠乳酸杆菌与双歧杆菌的作用和对大肠杆菌、肠球菌的抑制作用逐渐增强。正常+TB组与 TB+抗生素组相比，大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌的数量显著增加（P＜0.05），肠球菌数量增加，但差异不显著（P＞0.05）。

表4 正常对照组与模型组大鼠肠道菌群变化（±SD）Table 4 Changes of bacteria in normal control and model groups （±SD）

表4 正常对照组与模型组大鼠肠道菌群变化（±SD）Table 4 Changes of bacteria in normal control and model groups （±SD）

注：同列小写字母不同者，表示差异显著（P＜0.05）。“-”表示未检出。Note: The different lowercase letters in same columns mean significant difference （P＜0.05）. "-" means not checked out.

cfu·g-1组别Group 　　大肠杆菌Colon bacillus 　　肠球菌Enterococcus 　　乳酸杆菌Lactobacillus 　　双歧杆菌Bifidobacterium正常组Normal group 　8.77±0.13 　8.90±0.15 　10.7±0.24 　9.84±0.16a抗生素组Antibiotics group 　- 　- 　- 　8.69±0.12b

表5 普通饲料组大鼠肠道主要菌群变化（±SD）Table 5 Changes of four bacteria in the group feeding ordinary food （±SD）

表5 普通饲料组大鼠肠道主要菌群变化（±SD）Table 5 Changes of four bacteria in the group feeding ordinary food （±SD）

注：同行间小写字母不同者，差异显著（P＜0.05）。下同。Note: The different lowercase letters of same line mean significant difference （P＜0.05）. The same below.

cfu·g-1项目Item正常对照组Normal group TB+抗生素组TB+Antibiotics group正常+TB组Normal+TB group大肠杆菌 　8.97±0.41a　8.75±0.10b　8.51±0.15c灌胃7 d后Gavage after 7 d肠球菌 　8.52±0.30a　8.29±0.34b　8.07±0.10c乳酸杆菌 　8.45±0.17c　8.68±0.05b　8.99±0.28a双歧杆菌 　9.86±0.22c　9.92±0.07b　10.28±0.03a大肠杆菌 　8.67±0.32a　8.12±0.28c　8.45±0.22b灌胃14 d后Gavage after 14 d肠球菌 　8.31±0.08a　7.85±0.36b　7.93±0.15b乳酸杆菌 　9.54±0.25b　8.89±0.08c　9.99±0.32a双歧杆菌 　9.96±0.16b　9.98±0.08b　10.34±0.26a

2.3 高脂饲料组大鼠肠道菌群的变化

高脂饲料组大鼠肠道菌群的变化如表6。饲喂高脂饲料 7 d后，高脂+TB+抗生素组 4种菌群数量均小于其他两组，与高脂对照组相比，大肠杆菌与双歧杆菌数量降低显著（P＞0.05），表明在高脂条件下，即使有抗生素的存在，茶褐素仍然具有恢复大鼠肠道正常菌落的作用。高脂+TB组的大肠杆菌与肠球菌数量均少于高脂对照组，其中大肠杆菌数量显著降低（P＜0.05），乳酸杆菌与双歧杆菌数量显著高于高脂对照组（P＜0.05），表明在高脂条件下，茶褐素仍然具有增加大鼠肠道乳酸杆菌与双歧杆菌，抑制大肠杆菌与肠球菌的作用。

饲喂高脂饲料14 d后，高脂+TB组大肠杆菌与肠球菌数量进一步减少，乳酸杆菌与双歧杆菌进一步增加，且大肠杆菌数量显著低于高脂对照组（P＜0.05），乳酸杆菌与双歧杆菌数量显著高于高脂对照组（P＜0.05），表明随着时间的延长，茶褐素作用更明显。高脂+TB组与高脂+TB+抗生素组相比，大肠杆菌数量显著减少（P＜0.05），乳酸杆菌与双歧杆菌数量显著增加（P＜0.05），这有可能是抗生素使大鼠肠道环境紊乱，没有抗生素的条件下，茶褐素可以更好地发挥其作用。

对照同时高脂+TB组、高脂对照组相比的结果与正常+TB组、正常对照组相比的结果表明，在正常健康饮食模式下，茶褐素能发挥更大的效用。

表6 高脂饲料组大鼠肠道主要菌群变化（±SD）Table 6 Changes of four bacteria in the group feeding high fat food （±SD）

表6 高脂饲料组大鼠肠道主要菌群变化（±SD）Table 6 Changes of four bacteria in the group feeding high fat food （±SD）

cfu·g-1项目Item高脂对照组High fat control group高脂+TB+抗生素组Fatty+TB+Antibiotics group高脂+TB组Fatty+TB group大肠杆菌 　9.01±0.20a　8.78±0.12b　8.82±0.35b灌胃7 d后Gavage after 7 d肠球菌 　8.46±0.20a　8.33±0.28a　8.36±0.15a乳酸杆菌 　8.86±0.37b　8.73±0.05b　9.15±0.36a双歧杆菌 　10.27±0.17b　10.07±0.10c　10.43±0.15a大肠杆菌 　8.86±0.20a　8.73±0.37a　8.26±0.29b灌胃14 d后Gavage after 14 d肠球菌 　8.43±0.08a　8.44±0.11a　8.28±0.18a乳酸杆菌 　9.80±0.12b　9.09±0.06c　9.92±0.20a双歧杆菌 　10.49±0.37b　10.05±0.03c　10.75±0.34a

3 讨论与结论

人体肠道里含有 1013～1014个微生物，被视为人体内的超级器官。肠道微生物与人体之间存在着千丝万缕的联系。肠道微生物影响人体的能量代谢和宿主免疫功能，影响药物的代谢、毒性和有效性，也可能是肥胖、高血压、糖尿病、冠心病和中风等代谢性疾病的直接诱因［22］。人体产生的代谢产物有两类，一类是人体本身细胞代谢产生的；另一类由人体和肠道微生物共同代谢产生的，比如马尿酸、3-羟基苯丙酸（3-HTP）［23］、短链脂肪酸丁酸、乙酸和甲酸（SCFA），以及甲基胺类的代谢物如二甲胺（DMA）、三甲胺（TMA）和氧化三甲胺（TMAO）等。因此，通过调控机体的肠道微生物来增强机体潜在抗疾病能力、改善机体健康状态有重要意义。

脱污染是将正常微生物菌群全部或部分去除的措施，常见于科学研究中。连续7 d给与抗生素灌胃，模型组大鼠粪便变稀，出现腹泻现象，肛门四周微红，盲肠肿大，肠壁变薄，盲肠内容物呈水状，并且主要肠道菌群数量与正常对照组相比明显下降。本试验结果表明，庆大霉素、磺苄青霉素、头孢霉素和两性霉素的混合使用能造成典型的菌群失调模型，是制备肠道脱污染大鼠模型的较理想药物。本试验中TB+抗生素组与高脂+TB+抗生素组大鼠肠道主要菌群在灌胃茶褐素后均大幅上升，这表明不管是饲喂普通饲料还是高脂饲料，茶褐素均能显著改善抗生素的脱污染作用，调整肠道菌群的失调。

肠道正常微生物菌群是一组庞大的生态系统，一旦因某种原因破坏了这一稳定的生态平衡，机体就会出现生态失调反应。正常+TB组与TB+抗生素组相比，表明抗生素造成了大鼠肠道菌群的失调，而且茶褐素在正常肠道微生态环境下发挥作用优于有抗生素存在的微生态环境。肠道中的双歧杆菌和乳酸杆菌在机体内的有益作用已为人们所共识，它们可以调整机体的微生态平衡，改善消化功能，增强机体的免疫能力，延缓衰老。本试验表明，茶褐素具有促进大鼠肠道乳酸杆菌、双歧杆菌增殖和抑制大肠杆菌、肠球菌生长的作用。且随着处理时间延长，效果更加明显；正常健康饮食模式下，茶褐素能发挥更大效用。另一方面，双歧杆菌和乳酸杆菌在自身代谢中也会产生乳酸，使肠道pH值降低，肠道的酸性环境具有较强的抑菌和杀菌作用，能够控制病原菌的生长和繁殖。乳酸杆菌等在肠道产生的有机酸和细菌素（一种蛋白质），在肠道中可以抑制大肠杆菌等腐败细菌的生长［24］。

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中图分类号：TS272.5+4；Q946.84+1；Q939.1

文献标识码：A

文章编号：1000-369X（2016）03-261-07

收稿日期：2015-10-26

修订日期：2016-01-19

基金项目：国家自然科学基金（31260195）资助

作者简介：岳随娟，女，硕士研究生，主要从事普洱茶功能研究。*通讯作者：gong199@163.com

Effects of Theabrownin Extracted from Pu-erh Tea on the Intestinal Flora

YUE Suijuan， LIU Jian， GONG Jiashun*
Yunnan Agriultural University Institute of Food Science and Technology， Kunming 650201， China

Abstract:In this study， theabrownin （Mw＞50 kDa， TB） extracted from pu-erh tea was used as experimental material， and the effects of theabrownin to the intestinal flora of rat was studied. The results showed that the theabrownin had remarkable effects on the intestinal flora in rats. TB could significantly improve the de-pollution of antibiotics and adjust the intestinal flora imbalance. It was found that TB could promote the proliferation of Bifidobacterium and Lactobacillus and inhibit the proliferation of Escherichia coli and Enterococcus. The effects are more obvious with increasing culture time. In turn， microbes proliferate can accelerate the catabolism of theabrowns. Keywords: Pu-erh tea theabrownin， intestinal flora， metabolic， rat