茯茶水提物对Ⅱ型糖尿病小鼠糖代谢紊乱的干预作用

黄颂1， 2，刘仲华1， 2， 3，黄建安1， 3，阳衡1， 2，李勤1， 2， 3*

茯茶水提物对Ⅱ型糖尿病小鼠糖代谢紊乱的干预作用

黄颂1， 2，刘仲华1， 2， 3，黄建安1， 3，阳衡1， 2，李勤1， 2， 3*

1. 湖南农业大学 教育部茶学重点实验室，湖南 长沙 410128；2. 国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；3. 湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410128

摘要：采用高脂高糖饲料联合链脲佐菌素诱导Ⅱ型糖尿病小鼠模型，研究茯砖茶水提物对Ⅱ型糖尿病小鼠的降糖功效。结果表明，茯茶水提取物干预能显著改善糖尿病小鼠多食、多饮、多尿、消瘦症状，降低空腹血糖浓度，提高机体对糖负荷的耐受性，提升胰岛素和胰岛素敏感水平，降低胰岛素抵抗水平。同时，qRT-PCR分析发现，茯茶水提物通过增强PPAR-α、GLUT2和GLUT4基因表达，促进了葡萄糖转运和肝脏内脂质代谢，从而改善糖尿病小鼠体内糖代谢紊乱。综上所述，茯茶能显著改善Ⅱ型糖尿病小鼠糖代谢紊乱症状，其中中、高剂量茯茶效果最为显著。

关键词：茯茶水提物；Ⅱ型糖尿病；降糖；糖代谢

糖尿病（Diabetes，DM）是指以持续高血糖为基本生化特征的代谢性疾病，由胰岛素分泌不足和（或）胰岛素抵抗导致慢性血糖增高而引起组织、器官功能紊乱，以及其他特殊类型的疾病［1］，其中Ⅱ型糖尿病所占比例约为95%。现已成为继肿瘤、心血管疾病之后，威胁人类健康的第三大杀手。

我国与日本民间很早就有利用粗老茶叶治疗Ⅱ型糖尿病的传统。很多流行病学调查表明，喝茶能降低患Ⅱ型糖尿病的风险［2-4］。多项研究报道绿茶中茶多糖具有降血糖功效，绿茶可以降低糖尿病小鼠血糖水平，促进健康人体葡萄糖代谢，同时也有发现，绿茶对糖尿病起到防治作用［5-6］。Polychronopoulos等［7］也指出，饮茶能有效降低血糖水平，应该成为保障公众健康的一个重要策略。茶叶界学者普遍认为，茶叶中儿茶素类物质与抗氧化相关，而多糖类物质能起到调节血糖的作用［8-9］。近年来研究结果还表明，糖脂代谢与胰岛素抵抗密切相关，脂质分布和糖代谢的异常，可以导致机体更为显著的胰岛素抵抗和高胰岛素血症，进而出现更严重的糖脂代谢紊乱［10-11］。

茯砖茶主产于中国湖南省，是西北边疆人民的生活必需品，其特殊之处在于加工过程中独有的“发花”工序产生大量金黄色微生物，俗称“金花”［12］。近年来，茯砖茶由于其众多的生理功能，特别是降脂减肥作用，而受到国内外广泛关注［13］。经前期研究发现，茯砖茶能显著改善高脂高糖饮食所致的糖脂代谢紊乱、抑制细胞内脂质积累从而达到降脂减肥的效果［14］。因此，本研究拟通过高脂高糖饮食联合链脲佐菌素（Streptozotocin， STZ）注射诱导建立Ⅱ型糖尿病动物模型，用茯砖茶饲喂模型小鼠，探明茯砖茶改善Ⅱ型糖尿病的功效及其机理，以期为开发具有预防糖尿病功能性茶产品提供科学理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物和饲养条件

Babl/c小鼠（SPF级），雄性50只，体质量 13～14 g，3～5周龄，购自长沙斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证：CXK（湘）2011-003。动物实验经湖南农业大学动物实验委员会批准，饲养于湖南农业大学茶叶研究所动物实验中心。动物房室温23～25℃，湿度 40%～70%，光照时间 12 h昼夜交替，保证环境通风，饮用水壶等均经过消毒处理，定时添加饲料和水，每日更换1次垫料。

1.2 主要试剂和药品

茯砖茶（2007年金湘益，每片800 g，益阳茶厂）、血糖试纸（活力Ⅱ型，罗氏公司）、链脲佐菌素（STZ，Sigma公司）；SYBR®Premix Ex Taq™试剂盒（日本TaKaRa公司）、Reverse transcription quantitative real-time PCR（qRT-PCR）引物（中国上海生物工程技术有限公司）。

1.3 主要实验仪器

血糖仪（活力Ⅱ型，罗氏公司）冷冻干燥机（Modulyod-230型，美国热电公司），旋转浓缩仪（BUCHI R-200，瑞士BUCHI R公司），紫外分光光度计（日本 Shimadzu 公司，UV-2550），冷冻离心机（MIKRO 22R 型台式，德 国Hettich公 司 ），Thermo Scientific Varioskan Flash酶标仪（美国Thermo 公司），Leica DM2000生物显微镜（德国徕卡公司），荧光定量 PCR仪（德国 Qiagen公司，Rotor-Gene Q 6200）电子天平，FLUKOF6/10超细匀浆机，水浴锅，解剖器械等。

1.4 实验方法

1.4.1 茯砖茶水提物的制备

将茶砖粉碎，按1∶10茶水比沸水中浸提30 min，稍微冷却，用双层滤布过滤，离心，旋转蒸发仪浓缩至一定浓度，于-20℃预冷12 h后真空冷冻干燥24 h。收集干粉，密封包装，-80℃保存待用。

1.4.2 动物实验

小鼠于动物实验房适应性喂养1周后，将实验小鼠随机选择分为基础饲料喂养组（Pretreatment normal control， PNC，10只）和高脂高糖饲料喂养组（Pretreatment model control，PMC，40只），各饲喂4周后所有小鼠隔夜禁食不禁水，PMC组腹腔注射100 mg·kg-1STZ溶液，PNC组腹腔注射等体积缓冲液。72 h后，禁食不禁水，尾部静脉取血，测定空腹血糖值（Fasting blood glucose， FBG）。FBG大于 11.1 mmol·L-1的小鼠，一周后再次测定FBG，若FBG大于11.1 mmol·L-1，则表明Ⅱ型糖尿病小鼠模型建立成功。FBG小于 11.1 mmol·L-1的小鼠补注100 mg·kg-1STZ溶液，一周后再次测定 FBG，直到 FBG大于 11.1 mmol·L-1。将 PNC组随机选取 8只小鼠作为空白对照组（NC组），Ⅱ型糖尿病模型建立成功的小鼠随机分为4组：模型组（MC组）、低剂量茯茶组（LFT组）、中剂量茯茶组（MFT组）、高剂量茯茶组（HFT组），每组 8只，继续饲喂 4周并给予茯茶干预。每天灌胃 1次，具体条件见表1。

表1 分组及给药剂量Table 1 Grouping and dosage

1.4.3 指标测定

（1）日常观察指标：实验期间观察动物精神、活动、毛色，及尿量粪便变化情况［15-16］；每天定时测定每组动物摄食量和摄水量，每3 d测定体重。

（2）空腹血糖值（Fasting blood glucose，FBG）测定：分组前及给药后每7 d对各小鼠采取尾静脉取血测FBG。所有动物均禁食16 h（禁食不禁水），尾静脉取血 10 µL，使用罗氏血糖试纸和罗氏血糖仪测定。

（3）糖耐量（Oral glucose tolerance test，OGTT）的测定：灌胃3周后，各组动物禁食16 h（禁食不禁水），尾静脉取血10 µL，测定给葡萄糖前（即 0 h）血糖值，然后各组动物喂饲 2.5 g·kg-1葡萄糖，分别测定各组在给予葡萄糖后 0.5、1.0、1.5、2.0 h的血糖值，并计算血糖曲线下面积（Area under the curve of blood glucose， AUC）［17］。

（4）血糖曲线下面积：AUC=［0.5×（0 h血糖值+0.5 h血糖值）×0.5］+［0.5×（0.5 h血糖值+1.0 h血糖值）×0.5］+［0.5×（1.0 h血糖值+1.5 h血糖值）×0.5］+［0.5×（1.5 h血糖值+2.0 h血糖值）×0.5］

（5）胰岛素及胰岛素敏感指数（Insulin sensitivity index， ISI）测定：连续给药28 d后，各组动物禁食 16 h（禁食不禁水），摘取眼球取血，将血液静置30 min后，3 500 r·min-1，离心10 min，取上清液。应用双抗夹心酶联免疫法（ELISA），严格按照试剂盒说明书（武汉华美生物工程有限公司）步骤测定胰岛素含量。根据 HomaModel，计算胰岛素抵抗指数（IRI）及胰岛素敏感指数（ISI）指标，公式为：IRI=［空腹血清胰岛素（FINS）×空腹血糖（FBG）］÷22.5，ISI=ln［1/（空腹血清胰岛素（FINS）×空腹血糖（FBG））］［18-19］。

（6）胰腺组织病理切片：将小鼠处死解剖后，取小鼠胰腺组织置于4%中性福尔马林液中固定，送至湖南省实验动物中心进行胰腺组织HE染色切片制作，通过脱水透明、浸蜡包埋、切片与贴片、脱蜡染色、脱水透明、封蜡等步骤，切片制作好后取回进行病理学观察［20-21］。

（7）实时荧光定量PCR检测（qRT-PCR）：用 Trizol提取肝脏组织中总 RNA（按 Trizol说明书操作）。按试剂盒方法（SYBR®Premix Ex Taq™， Takara）进行RT-PCR。分别检测肝脏组织中AMPK-α、PPAR-α、PPAR-γ、GLUT2、GLUT4 mRNA变化情况。以β-actin为内参，NC组为对照组。糖代谢相关基因引物设计采用Primers 5软件及参考文献进行［22-26］，引物序列见表2。RT-PCR反应条件：预变性95℃10 min，变性95℃ 10 s。退火58℃ 15 s，延伸72℃ 20 s，40个循环。计算每一样品与内参物的相对含量［27］。

1.4.4 数据处理及结果判定

实验数据采用SPSS18.0统计软件进行统计分析，结果以±SD表示，One-Way ANOVA（单因素方差分析）检验差异显著性（与模型组比，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照比，#P＜0.05，##P＜0.01，n=8）。

表2 糖脂代谢相关引物Table 2 Primers of glucose and lipid metabolism genes

2 结果与分析

2.1 高脂高糖饲料联合链脲佐菌素诱导Ⅱ型

糖尿病小鼠模型的建立

如图1所示，腹腔注射100 mg·kg-1STZ溶液72 h后，PNC组FBG相对稳定，PMC 组 FBG则明显升高，且超过造模阈值 11.1 mmol·L-1。注射7 d后用相同方法测定两组小鼠空腹血糖值，发现PNC组FBG无明显变化，PMC组FBG略有下降且趋于稳定，并超过造模阈值11.1 mmol·L-1，说明Ⅱ型糖尿病小鼠模型造模成功。

2.2 对小鼠生活状态的影响

造模成功后，各处理组与NC组相比，小鼠体毛稀疏无光泽且不柔顺，行动迟缓，排尿量大，垫料湿润，且腿部和尾部出现了不同程度溃烂，体重也在逐步减轻。经4周茯茶干预后，MFT组、HFT组与灌胃初期相比，体毛慢慢变茂密柔顺，腿部和尾部溃烂程度也较MC组有所改善，排尿量减少，垫料开始变干燥。如图2所示，MC组、LFT组、MFT组、HFT组和NC组间摄食量无明显变化。但MC组、LFT组、MFT组、HFT组饮水量显著高于NC组（P＜0.01），且经茯茶干预后，与MC组相比，LFT组、MFT组饮水量显著降低（P＜0.05），HFT组饮水量极显著降低（P＜0.01）。结果表明，Ⅱ型糖尿病“三多一少”典型症状有一定程度的好转。

图1 糖尿病小鼠造模期间空腹血糖值的变化Fig. 1 Changes in the fasting blood glucose in diabetic mice

图2 茯砖茶对糖尿病小鼠摄食量及饮水量的影响Fig. 2 Effects of Fuzhuan brick tea water extract on food intake and drinking amount of diabetic mice

2.3 对小鼠体重和肝体比的影响

表3显示，经4周饲养，NC组小鼠体重略有增加，MC组、LFT组、MFT组和HFT组体重逐渐降低。但经茯茶干预的LFT组、MFT组和HFT组与MC组比较，小鼠从第2周开始体重降幅度逐渐减小，但无显著性差异（P＞0.05），表明茯茶处理对Ⅱ型糖尿病所致体重降低有一定抑制作用。小鼠肝体比是指肝脏质量与体质量的比值，是判断小鼠肝脏是否病变的重要指标。如图3所示，MC组、LFT组、MFT组、HFT组肝体比显著高于NC组（P＜0.05）。经茯茶干预后，LFT组、MFT组、HFT组肝体比与MC组相比有一定程度降低，但均无显著性差异（P＞0.05）。

表3 茯砖茶对糖尿病小鼠体质量的影响Table 3 Effects of Fuzhuan brick tea water extract on weight body of diabetic mice

注：同一列中，与空白对照组比较，##：P＜0.01。

Note: In the same column， ##: P＜0.01， compared with basic control group.

图3 茯砖茶对糖尿病小鼠肝体比的影响Fig. 3 Effects of Fuzhuan brick tea water extract on the ratios of liver to body weight in diabetic mice

2.4 对小鼠FBG和OGTT的影响

如图4所示，经高脂高糖和STZ诱导后，MC组、LFT组、MFT组和HFT组的FBG远高于NC组。茯茶干预2周（14 d）后，MFT组和HFT组FBG与MC组相比呈下降趋势，但无显著性差异（P＞0.05）；茯茶干预4周（28 d）后，MFT组和HFT组FBG与MC组相比显著降低（P＜0.01），且呈一定量效关系。此结果表明，中高剂量茯茶水提物对FBG升高有着显著抑制作用。

OGTT是检查集体血糖调节机能的方法。如图5所示，MC组、LFT组、MFT组、HFT组小鼠AUC值均有大幅度升高，且与NC组有极显著差异（P＜0.01）。LFT组AUC值略低于MC组，两组间无显著差异（P＞0.05），MFT组、HFT组AUC值与MC组相比显著降低（P＜0.05）。结果表明中高剂量茯茶水提物可以显著抑制葡萄糖负荷后血糖值的升高。

图4 茯砖茶对糖尿病小鼠试验期间空腹血糖值的影响Fig. 4 Effect of Fuzhuan brick tea water extract on the fasting blood glucose in diabetic mice

图5 各组糖耐量实验AUC值比较Fig. 5 The AUC results of each group in tolerance test

2.5 对小鼠胰岛素敏感指数的影响

茯砖茶对糖尿病小鼠胰岛素抵抗指数（IRI）及胰岛素敏感指数（ISI）的影响如表4所示。经高脂高糖饲料联合STZ诱导后，MC组与NC组相比，IRI水平极显著升高（P＜0.01），而ISI水平极显著降低（P＜0.01）。经茯茶干预后，MFT组、HFT组与MC组相比，IRI水平权显著降低（P＜0.01），而ISI水平极显著升高（P＜0.01）。

表4 茯砖茶对糖尿病小鼠IRI及ISI的影响Table 4 Effects of Fuzhuan brick tea water extract on IRI and ISI in diabetic mice

2.6 对小鼠胰腺组织形态的影响

形态学观察表明，NC组（图 6-1）胰岛显示正常组织学特性，胰岛以圆形或椭圆形细胞团居多，分散在胰腺腺泡之间，界限清楚，数量较多；胰岛内胰腺细胞数量多，排列紧密，细胞质丰富，细胞核多为圆形，核分布和大小比较均匀。MC组（图 6-2）胰岛数量明显减少，分布比较稀疏且形态不规则，体积相应减小，胰岛内细胞数量不均匀，细胞数量明显减少，有的细胞数量过于紧密，并呈各种不规则形状，染色过深。LFT组（图6-3）与模型组类似，MFT组（图6-4）和HFT组（图6-5、6-6）胰岛形状有初步好转，呈有一定规则图形，且胰腺细胞分布较为均匀紧密。说明MFT、HFT可以一定程度上修复胰腺细胞损伤，恢复其组织形态，由于是运用STZ造模，化学损了试验小鼠胰腺组织，茯茶水提物还没有起到明显修复或者治愈胰腺损伤的作用。

图6 茯砖茶对糖尿病小鼠胰腺组织形态结构的影响Fig. 6 Effect of Fuzhuan brick tea water extract on the pancreatic tissue morphology in diabetic mice

图7 茯砖茶对糖尿病小鼠肝脏中糖代谢相关基因相对表达量的影响Fig. 7 Effect of relative expressions of the genes involved in glucose metabolism in the livers of diabetic mice

2.7 对小鼠肝脏糖代谢相关基因表达的影响

qRT-PCR分析发现，MC组与NC组相比，PPAR-γ和 PPAR-α基因均显著下调表达（PPAR-γ：0.433，P＜0.01；PPAR-α：0.434，P＜0.01），AMPK-α、GLUT2和GLUT4基因也有一定程度下调表达（AMPK-α：0.971，GLUT2：0.822，GLUT4：0.790），但无显著性差异（P＞0.05）。经茯茶干预后，分析组间各基因表达比值，LFT组与 MC组相比，AMPK-α、PPAR-α、GLUT2和GLUT4基因均有一定程度上调表达（AMPK-α：1.438，PPAR-α：1.365，GLUT2：1.105，GLUT4：1.380），但均无统计学差异（P＞0.05）；PPAR-γ基因有一定程度下调表达（0.882），但无显著性差异（P＞0.05）。MFT组与MC组相比，PPAR-α和GLUT2基因显著上调表达（PPAR-α：1.877，P＜0.05；GLUT2：1.929，P＜0.01），AMPK-α、PPAR-γ和GLUT4基因也有一定程度上调表达（AMPK-α：1.667， PPAR-γ：1.016，GLUT4：1.785），但均无统计学差异（P＞0.05）。HFT组与MC组相比，PPAR-α、GLUT2和 GLUT4基因显著上调表达（PPAR-α：1.886，P＜0.05；GLUT2：1.678，P＜0.05；GLUT4：2.430，P＜0.05），而AMPK-α和PPAR-γ基因有一定程度上调表达（AMPK-α：1.586，PPAR-γ：1.583），但无显著性差异（P＞0.05）（图7）。

3 讨论

茶叶中茶多酚、茶多糖、茶色素等是抑制血糖升高的主要活性成分［28-30］。茯砖茶是经过复杂发酵工艺而制成的后发酵茶，发酵后茯砖茶茶褐素含量增加。与其他茶类相比，茯茶有特殊的“发花”工序，金花是成就茯砖茶独特品质的主要因子，因此它具有独特品质特征及功效，但其相关功能研究目前报道尚少［13， 31］。降血糖、降血脂是茯砖茶最为突出的功效之一，其作用机制也是众多学者的研究重点。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是细胞重要的能量感受器，在调节细胞和机体水平能量平衡中具有重要作用。AMPK在调节机体能量代谢平衡方面起总开关作用，AMPK活化能增强葡萄糖摄取、脂肪酸氧化作用和胰岛素敏感性，从而减少葡萄糖、胆固醇、甘油三酯产生［32］。AMPK促使周缘组织葡萄糖摄取，有两种方式：一是诱导GLUT4向浆膜转移，二是通过磷酸化转录因子，开启GLUT4基因表达。葡萄糖转运蛋白（GLUs）是细胞转运葡萄糖的载体，其中GLUT2和GLUT4尤为重要。GLUT2是胰岛β细胞膜上的转运蛋白，在血糖浓度升高时，促进GLUT2对葡萄糖转运功能，继而刺激胰岛素释放。胰岛素刺激GLUT4表达及GLUT4分子转移到细胞膜上，促进葡萄糖分子转运过程［33］。PPAR-γ是一类核激素受体，在调节糖脂代谢，减轻炎症进而改善胰岛素抵抗方面起着重要作用。在体内各组织中有着不同程度表达，在体内与配体结合后被激活，通过与目的基因启动子内PPRE作用，激活或抑制下游基因转录［34］。PPAR-γ活化后能促进GLUT2、GLUT4表达，PPAR-γ被激活后能够促进前脂肪细胞分化，增加小脂肪细胞数量，小脂肪细胞对胰岛素敏感性更强，因此增强脂肪组织对胰岛素的敏感性，改善胰岛素抵抗，同时PPAR激动剂也能够刺激脂肪组织和骨骼肌中游离脂肪酸和葡萄糖代谢。本研究中，茯茶处理后GLUT2和GLUT4基因显著上调表达，而AMPK-α和PPAR-γ基因虽有一定程度上调表达，但无统计学差异。表明茯茶可能是通过增强GLUs类基因表达，从而促进葡萄糖跨膜转运及胰岛素信号传递。PPAR-α主要存在脂代谢密切相关组织中，可以促进肝脏脂代谢［35］。茯茶处理后MFT组和HFT组小鼠肝脏PPAR-α基因显著上调表达，通过促进肝脏内脂代谢，改善由于脂中毒引起的胰岛素抵抗，提高周缘组织对胰岛素的敏感性。因此我们认为茯茶水提物通过增强 PPAR相关基因的表达，从而调节胰岛素抵抗及促进体内能量消耗和脂肪分解。

综上所述，茯茶水提取物干预能显著改善糖尿病小鼠多食、多饮、多尿、消瘦症状，降低空腹血糖浓度，提高机体对糖负荷的耐受性，提升胰岛素和胰岛素敏感水平，降低胰岛素抵抗水平。同时，qRT-PCR分析发现，茯茶水提物通过增强PPAR-α、GLUT2和GLUT4基因表达，促进了葡萄糖转运，肝脏内脂质代谢，促进胰岛素释放，提高对胰岛素的敏感性，从而改善糖尿病小鼠体内糖代谢紊乱。

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中图分类号：TS272.5+4；R587.1

文献标识码：A

文章编号：1000-369X（2016）03-250-11

收稿日期：2015-11-17

修订日期：2016-01-25

基金项目：国家自然科学基金（31471706）、湖南省自然科学基金（13JJ4067）、湖南省科技项目（15C0670）、湖南农业大学引进人才科学基金（13YJ13）。

作者简介：黄颂，男，硕士研究生，主要从事茶叶功能成分化学研究。*通讯作者：liqinvip@126.com

Intervention Effects of Fuzhuan Brick Tea Water Extract on Glucose Metabolism Disorder in a Mouse Model of Type Ⅱ Diabetes Mellitus

HUANG Song1， 2， LIU Zhonghua1， 2， 3， HUANG Jian′an1， 3， YANG Heng1， 2， LI Qin1， 2， 3*
1. Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China；2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals， Changsha 410128， China；3. Hunan Co-Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients， Changsha 410128， China

Abstract:In this study， streptozotocin （STZ） combined with a high-fat and high-sugar diet was used to generate a mouse model of type 2 diabetes mellitus. The aim of this study was to investigate the hypoglycemic effects of Fuzhuan brick tea water extract （FTEs） on T2DM-Mice. Results showed that FTEs could obviously alleviate weight loss， polyuria， polydipsia， and polyphagia， reduce fasting plasma glucose， increase sugar tolerance， enhance insulin concentrations and insulin sensitivity and decrease insulin resistance in the diabetic mice. Moreover， RT-qPCR analysis showed that FTEs promoted glucose transport and liver lipid metabolism， and improved the glucose metabolism in the diabetic mice by increasing the expression of PPAR-α， GLUT2， and GLUT4. Therefore， it can be concluded that FTEs could significantly improve glucose metabolism disorder symptom of T2DM-Mice by a dose-dependent manner.

Keywords:Fuzhuan brick tea water extract， type 2 diabetes mellitus， hypoglycemic， glucose metabolism