普洱茶对非酒精性脂肪肝大鼠肠道脂肪吸收及粘膜屏障的干预研究

朱晟易，童钰铃，赵奕，吕海鹏，林智，沈国丽，孙婷，宋震亚*

普洱茶对非酒精性脂肪肝大鼠肠道脂肪吸收及粘膜屏障的干预研究

朱晟易1，童钰铃1，赵奕1，吕海鹏2，林智2，沈国丽1，孙婷1，宋震亚1*

1. 浙江大学医学院附属第二医院，浙江 杭州 310009；2. 农业部茶树生物学与资源利用重点实验室，中国农业科学院茶叶研究所，浙江 杭州 310008

摘要：研究了普洱茶调控非酒精性脂肪肝大鼠肠道对长链脂肪酸的吸收，并探讨了其可能机制。将 36只 SD大鼠随机分成正常对照组、脂肪肝模型组和普洱茶干预组，每组12只。实验第8周末处死所有大鼠，测定大鼠体质量、肝指数及血清血脂水平；采用定量 PCR测定大鼠肠道黏膜脂质吸收相关蛋白细胞分化抗原 36 （Cluster of differentiation 36，CD36）、紧密连接相关蛋白如闭锁蛋白（Occludin）、紧密连接蛋白（Zonula occludens 1，ZO-1）和肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α， TNF-α）基因表达水平。研究结果表明，与模型组相比，普洱茶组大鼠体质量和血清 LDL-C水平分别下降了 16.12%和 42.59%；此外，普洱茶组大鼠小肠组织CD36、TNF-α表达水平明显降低，而Occludin、ZO-1表达水平明显升高。研究发现，普洱茶对NAFLD大鼠肠道长链脂肪酸吸收及肠道紧密连接蛋白有一定程度的调控作用，尤其是对NAFLD早期发生发展中游离脂肪酸过度沉积的“第一次打击”有防治价值。

关键词：普洱茶；非酒精性脂肪性肝病；脂质代谢；紧密连接

非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种除外酒精因素或其他明确病理原因导致的以肝实质细胞脂质过度沉积为主要特征的临床病理综合征［1］，为全球重要的肝病，也是中国第二大肝病，同时与肥胖、心脑血管疾病、糖尿病等的发生发展有密切关系。在NAFLD的发生发展过程中，过多游离脂肪酸沉积是“一次打击”；蓄积的游离脂肪酸通过反应性氧化物对肝脏进行“二次打击”，促使肝脏单纯性脂肪肝向非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化发展［2］。采用非药物手段改善早期肝脏脂质沉积是NAFLD防治工作中极其重要的一环。

肠道作为食物吸收的主要器官，在NAFLD的发生发展中可能起到重要的作用。脂肪消化后的主要成分中长链脂肪酸（Long chain fatty acids，LCFA）的吸收与小肠吸收细胞膜蛋白脂肪酸转位酶细胞分化抗原 36 （Cluster of differentiation 36，CD36）密切相关［3］。另有研究显示，NAFLD患者存在小肠粘膜上皮细胞紧密连接结构受损，肠道紧密连接蛋白（Tight junction proteins，TJPs）Occludin 和 ZO-1表达下调［4］，而上皮细胞 TNF-α表达水平上升［5］的现象，表明可能因为肠粘膜屏障功能减弱使更多细菌内毒素进入血液循环，通过一系列炎症反应造成肝细胞损伤［6］。

茶叶是一种保健饮品，科学研究已经证实它在促进脂肪代谢、减轻体质量，以及减肥成功后的体质量维持等多方面均有良好的表现［7-10］。普洱茶是一种具有独特风味的微生物发酵茶，关于普洱茶的功效备受关注［11-12］。研究表明，普洱茶能在降低SD大鼠血液中的LDL-C水平的同时提高 SD大鼠血液中的HDL-C水平，而绿茶、红茶以及乌龙茶等只能同时降低二者的水平［13］。我们前期的研究发现，普洱茶能够改善NAFLD大鼠肝脏脂肪变性［14］。然而，目前尚无关于普洱茶对NAFLD肠道影响的研究报道。因此，本实验拟通过对大鼠体质量、肝湿重及血清血脂水平的变化，以及肠粘膜CD36、Occludin、ZO-1 和 TNF-α等基因表达的研究，来分析探讨普洱茶对肠道脂肪吸收与粘膜屏障干预的可能机制，旨在为今后将普洱茶应用于非酒精性脂肪性肝病的防治提供科学依据和重要参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

普洱茶（熟茶，散茶，云南德宏志诚茶叶有限公司提供），胆固醇（杭州昊天生物技术有限公司），Trizol试剂、Realtime PCR引物［英潍捷基（上海）贸易有限公司］，ReverTra Ace®逆转录试剂盒、SYBR Green® Realtime PCR试剂［东洋纺（上海）生物科技有限公司］，分光 光度 计 （Nano Drop 1000， Thermo Scientific），RT-PCR仪（Applied Biosystems StepOnePlusTM Real-Time PCR System）。

1.2 实验方法

1.2.1 普洱茶茶水提取物的制备

按照 1︰15的茶水比例，将普洱茶在100℃沸水中浸提4次，每次持续10 min；将4次的提取液合并后，用脱脂棉过滤，最后将滤液经冷冻干燥，得到普洱茶水提物粉末，并将其置于4℃冰箱保存待用。

1.2.2 动物模型

SD大鼠，清洁级，4～5周龄，雄性，体质量（135±8） g，36只，上海斯莱克实验动物有限公司［SCXK（沪）2007-0005］提供。动物饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心［SYXK（浙）2008-0115］，室温（23±2）℃，相对湿度60%～70%。

SD大鼠在实验环境下适应性喂养 1周后，随机分为3组：正常对照组、脂肪肝模型组、普洱茶干预组（分别简称对照组、模型组、普洱茶组），每组各12只。对照组给予普通饲料喂养，模型组和普洱茶组给予高脂饲料（84%普通饲料+14%猪油+2%胆固醇）喂养。从第5周起，普洱茶组每日分别给予普洱茶水提物 1.0 g·kg-1·d-1（根据体质量 60 kg成人每日普洱茶饮用量 10 g为标准以及提取过程中的水浸出物百分含量换算所得，计算公式：大鼠 的 剂 量 =10 g× 0.018/（0.2 kg）≈ 1.0 g·kg-1·d-1），经口灌胃，用蒸馏水稀释，另外两组每日给予等体积生理盐水经口灌胃。实验期间大鼠自由饮水和进食。

1.2.3 标本采集

第 8周末处死全部大鼠。处死前禁食 12 h，采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，断头处死。腹主动脉插管取血3 mL后取出肝脏称肝湿重并计算肝指数（肝指数=肝湿重/末次体质量×100%），取部分肝脏固定于4%中性福尔马林液中。迅速剪取上段小肠，使用预冷的 0.9%盐溶液清洗小肠标本内外，放于冻存管后存于-80℃冰箱。

1.2.4 大鼠血脂指标测定

采用全自动生化分析仪由浙江大学医学院附属第二医院检验科生化室协助测定血清TG，TC，HDL-C，LDL-C。

1.2.5 肝组织油红O染色

肝组织冰冻切片10 μm，油红O染色10 min，苏木素复染1 min，显微镜观察。

1.2.6 小肠组织RT-PCR。

取100 mg小肠标本，按Trizol法提取组织总 RNA。提取得到的 RNA样本按照ReverTra Ace®逆转录试剂盒说明操作制备complementary DNA（cDNA）用于RT-PCR，选用大鼠 GAPDH基因作为内参。本次实验PCR所用引物通过查阅相关文献及使用Primer Premier 5.0获得（表1）。

1.3 统计学方法

表1 本实验中使用的RT-PCR引物Table 1 RT-PCR primers used in this experiment

2 结果与分析

2.1 大鼠体质量、肝指数及血清血脂水平变化

普洱茶对大鼠体质量、肝指数及血清血脂水平的影响如表2和表3所示。模型组大鼠体质量、肝指数及血清LDL-C水平均明显高于对照组（P＜0.01），血清TG、TC及HDL-C水平无明显差异。与模型组相比，普洱茶组大鼠体质量和血清 LDL-C水平均显著降低（P＜0.01）分别下降16.12%和42.59%，而肝指数及血清TG、TC及HDL-C水平无明显差异（P＞0.05），说明普洱茶能减轻大鼠体质量，改善血清 LDL-C水平，具有明显的减肥、降脂作用。

表2 普洱茶对大鼠体质量、肝指数的影响Table 2 Effect of Pu-erh tea on body weight and liver index in NAFLD rats

表3普洱茶对大鼠血清血脂水平的影响Table 3 Effect of Pu-erh tea on serum TG， TC， HDL-C， LDL-C level in NAFLD rats

2.2 大鼠肝脏病理学的变化

采用油红 O染色各组大鼠肝组织脂肪沉积的情况如图1所示。从图1可以观察到，与正常饲料组比较，模型组大鼠肝细胞内脂滴呈弥漫性、颗粒状堆积，脂滴明显增大；普洱茶组大鼠肝细胞脂滴数量明显减少，散在稀疏，脂滴体积较小，脂肪病变明显改善；表明普洱茶对高脂引起的大鼠肝脏病理学的变化有明显的抑制作用。

2.3 大鼠小肠粘膜CD36 mRNA表达水平的变化

CD36主要存在于十二指肠和空肠，与小肠 LCFA吸收密切相关，其表达上调有利于LCFA转运入小肠细胞。由图2可知，模型组大鼠小肠组织 CD36 mRNA表达水平显著高于对照组（P＜0.01），提示进食高脂饮食能够促进小肠吸收细胞膜蛋白 CD36表达代偿性上调，从而导致肠道中LCFA大量进入小肠细胞内，并最终转运入肝脏。与模型组相比，普洱茶的 CD36 mRNA表达水平显著降低（P＜0.01）（图2），提示普洱茶能够一定程度下调小肠CD36的表达，减少从小肠上皮细胞膜外侧转运入细胞膜内侧的LCFA，从而减少脂肪酸输入肝脏，一定程度上起到降血脂和预防肝脏脂质沉积的作用。

2.4 大鼠肠粘膜紧密连接相关蛋白Occludin、

ZO-1 mRNA表达水平的改变

紧密连接是肠上皮细胞间的主要连接方式，位于相邻小肠上皮细胞膜之间，在正常情况下阻隔内毒素等大分子物质进入血液循环，其功能的实现受TJPs（Occludin、ZO-1）表达的调控。上皮细胞间紧密连接结构受损与NAFLD密切相关，有研究发现NAFLD患者肠粘膜 Occludin、ZO-1表达下调［4］，小肠粘膜紧密连接结构破坏，粘膜通透性增大。而我们试验中发现和对照组相比，模型组大鼠小肠组织Occludin、ZO-1 mRNA表达水平无明显差异（P＞0.05），原因可能在于我们的模型组大鼠处于NAFLD病情早期阶段，实验结束时间可能尚未达到NAFLD大鼠小肠紧密连接功能改变的切点。普洱茶组大鼠小肠组织Occludin、ZO-1 mRNA表达水平均显著高于模型组（P＜0.01）（图2），推测普洱茶能够通过上调Occludin和ZO-1的表达，一定程度上加强大鼠小肠上皮细胞间紧密连接结构，起到预防及改善NAFLD的作用。

图1 油红O染色各组大鼠肝组织脂肪沉积情况（×200）Fig. 1 Observation of fat deposition in liver tissue by oil red O staining（×200）

图2 普洱茶对大鼠小肠组织CD36、Occludin、ZO-1、TNF-α基因mRNA表达的影响Fig. 2 Effect of Pu-erh tea on intestinal CD36， Occludin， ZO-1， TNF-αgene expressions in NAFLD rats

2.5 对大鼠小肠组织TNF-α基因mRNA表达的影响

既往研究发现 NAFLD模型小肠细胞TNF-α表达升高，促进诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表达，使肠细胞一氧化氮（Nitric oxide，NO）合成增加［15］，从而下调小肠粘膜紧密连接蛋白的表达，小肠粘膜通透性增大，细菌内毒素大量进入血液循环［6］，到达肝脏后进一步造成肝脏的氧化损伤形成NAFLD“二次打击”。模型组大鼠小肠组织TNF-α mRNA表达显著高于对照组（P＜0.01），和既往的研究结论类似。普洱茶组大鼠小肠组织TNF-α mRNA表达水平均显著低于模型组（P＜0.01）（图2），说明普洱茶能够抑制大鼠小肠组织TNF-α的表达，下调iNOS的表达，从而减少NO的产生，保护小肠上皮细胞间紧密连接结构，一定程度上改善肠上皮细胞通透率，阻止过多的 LPS通过门静脉进入肝脏，并最终减少由过多 LPS导致的肝脏炎症损害。

3 结论与讨论

在NAFLD的发生发展过程中，早期肝脏的脂质沉积起到至关重要的作用［1］。过多游离脂肪酸的沉积对肝脏产生“一次打击”；蓄积的游离脂肪酸通过反应性氧化物对肝脏进行“二次打击”，促使肝脏单纯性脂肪沉积向非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化发展［1］。食物脂肪摄入，尤其是LCFA摄入增多是体内游离脂肪酸摄入的重要环节。小肠吸收细胞膜蛋白脂肪酸转位酶 CD36定位于小肠绒毛细胞刷状缘膜，与LCFA吸收密切相关［2］。本实验中第8周末模型组大鼠小肠组织 CD36 mRNA表达水平较对照组明显升高，提示进食高脂饮食能够促进小肠吸收细胞膜蛋白 CD36表达代偿性上调，从而导致肠道中LCFA大量进入小肠细胞内，并最终转运入肝脏。我们的研究发现，和模型组相比，普洱茶组大鼠小肠组织CD36 mRNA表达量显著降低，提示普洱茶能够下调小肠CD36的表达，减少小肠细胞LCFA的转运，从而减少肝脏脂肪酸的输入，从而起到降低血脂和改善肝脏脂质沉积的作用。

紧密连接结构属不通透连接，是小肠上皮细胞间的主要连接方式。正常情况下只允许水分子和离子从衔接处的小孔通过［16］，为最重要的肠粘膜屏障。目前已知的紧密连接相关蛋白主要有 Occludin［17］、ZO-1［18］等，其表达量调控着紧密连接的功能和肠上皮粘膜通透率。已有研究发现 NAFLD模型小肠细胞 TNF-α表达升高，促进iNOS的表达，使肠细胞一氧化氮合成增加［15］，增多的TNF-α及NO能够下调小肠粘膜紧密连接蛋白的表达，造成粘膜紧密连接结构破坏，小肠粘膜通透性增大，肠道革兰氏阴性菌产生的内毒素大量进入血液循环［6］，到达肝脏后进一步促进肝细胞TNF-α产生，诱导肝脏的氧化损伤形成NAFLD“二次打击”，最终导致肝脏炎症、坏死和纤维化。由此可见，小肠细胞 TNF-α水平及粘膜紧密连接结构受损与NAFLD密切相关。本研究再次证实了模型组小肠组织TNF-α mRNA水平高于正常对照组。而普洱茶组 TNF-α水平较脂肪肝模型组均明显下调，说明普洱茶能够抑制大鼠小肠组织 TNF-α的表达，进一步下调iNOS，从而减少NO的生成。既往文献发现，NAFLD患者 Occludin和 ZO-1表达下调［4］，而我们的研究发现，和对照组相比，模型组大鼠小肠组织Occludin、ZO-1 mRNA表达水平无明显差异，究其原因可能有以下几点，一为我们的研究对象为 NAFLD早期阶段造模大鼠，实验结束时间可能尚未达到NAFLD大鼠小肠紧密连接功能改变的切点；第二可能存在其他紧密连接蛋白的影响，或者紧密连接蛋白在 NAFLD早期阶段可能并不是数量上的改变，而是形态结构上的变化导致肠道通透性变化，需要进一步的探讨。普洱茶组大鼠小肠粘膜 Occludin、ZO-1表达水平明显升高，推测普洱茶能够上调Occludin和ZO-1的表达，加强大鼠小肠上皮细胞间紧密连接结构，起到预防及改善NAFLD的作用。这些研究结果证实了普洱茶对非酒精性脂肪肝大鼠肠道脂肪吸收及粘膜屏障的干预作用，其机理有待于进一步的研究。

普洱茶属于后发酵茶。微生物参与的后发酵加工过程奠定了普洱茶保健功效的化学物质基础，其原料晒青毛茶中的化学成分在高温高湿的环境中发生了复杂的生物转化，形成了一系列决定普洱茶风味品质的关键品质化学成分以及生物活性成分，例如茶褐素［19］、普洱素（8-C取代的黄烷-3-醇成分）［20］、他汀类成分［21］、没食子酸［22］、黄酮类成分［23-25］等。本文报道了普洱茶对调控NAFLD大鼠小肠组织相关基因表达的作用，但具体是由普洱茶中的哪种生物化学成分产生的，是否存在协同作用，这一系列的问题都具有重要的研究价值和研究意义。

参考文献

［1]Wieland AC， Mettler P， McDermott MT， et al. Low awareness of nonalcoholic fatty liver disease among patients at high metabolic risk ［J］. J Clin Gastroenterol， 2015， 49（1）: e6-e10.

［2]Ogawa Y， Imajo K， Yoneda M， et al. Pathophysiology of NAsh/NAFLD associated with high levels of serum triglycerides ［J］. Nihon Rinsho， 2013， 71（9）: 1623-1629.

［3]Glatz JF， Luiken JJ， Bonen A. Membrane fatty acid transporters as regulators of lipid metabolism: implications for metabolic disease ［J］. Physiol Rev， 2010， 90（1）: 367-417.

［4]Miele L， Valenza V， La Torre G， et al. Increased intestinal permeability and tight junction alterations in nonalcoholic fatty liver disease ［J］. Hepatology， 2009， 49（6）: 1877-1887.

［5]Park EJ， Thomson AB， Clandinin MT. Protection of intestinal occludin tight junction protein by dietary gangliosides in lipopolysaccharide-induced acute inflammation ［J］. J Pediatr Gastroenterol Nutr， 2010， 50（3）: 321-328.

［6]Reid AE. Nonalcoholic steatohepatitis ［J］. Gastroenterology，2001， 121（3）: 710-723.

［7]陈宗懋， 甄永苏. 茶叶的保健功能 ［M］. 北京: 科学出版社， 2014.

［8]Dulloo AG， Duret C， Rohrer D， et al. Efficacy of a green tea extract rich in catechin polyphenols and caffeine in increasing 24-h energy expenditure and fat oxidation in humans ［J］. Am J Clin Nutr， 1999， 70（6）: 1040-1045.

［9]Chen ZM， Lin Z. Tea and human health: biomedical functions of tea active components and current issues ［J］. J Zhejiang Univ Sci B， 2015， 16（2）: 87-102.

［10]Cao ZH， Gu DH， Lin QY， et al. Effect of pu-erh tea on body fat and lipid profiles in rats with diet-induced obesity ［J］. Phytother Res， 2011， 25（2）: 234-238.

［11]Hou Y， Shao W， Xiao R， et al. Pu-erh tea aqueous extracts lower atherosclerotic risk factors in a rat hyperlipidemia model ［J］. Exp Gerontol， 2009， 44（6/7）: 434-439.

［12]Lee LK， Foo K Y. Recent advances on the beneficial use and health implications of Pu-Erh tea ［J］. Food Research International， 2013， 53: 619-628.

［13]Kuo KL， Weng MS， Chiang CT， et al. Comparative studies on the hypolipidemic and growth suppressive effects of oolong， black， pu-erh， and green tea leaves in rats ［J］. J Agric Food Chem， 2005， 53（2）: 480-489.

［14]肖凯， 朱晟易， 童钰铃. 普洱茶水提取物对大鼠非酒精性脂肪性肝病的干预作用［J］. 第三军医大学学报， 2013: 35（18）: 1992-1995.

［15]Han X， Fink MP， Yang R， et al. Increased iNOS activity is essential for intestinal epithelial tight junction dysfunction in endotoxemic mice ［J］. Shock， 2004， 21（3）: 261-270.

［16]Harhaj NS， Antonetti DA. Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology ［J］. Int J Biochem Cell Biol， 2004， 36（7）: 1206-1237.

［17]许腊梅，孙丹莉，张予蜀. 紧密连接蛋白Occludin在非酒精性脂肪肝大鼠肠上皮细胞中的表达及其与 TNF-α的关系［J］. 世界华人消化杂志， 2010， 18（10）: 981-986.

［18]Fanning AS， Jameson BJ， Jesaitis LA， et al. The tight junction protein ZO-1 establishes a link between the transmembrane protein occludin and the actin cytoskeleton ［J］. J Biol Chem， 1998， 273（45）: 29745-29753.

［19]Liang Y， Zhang L. A study on chemical estimation of pu-erh tea quality ［J］. Journal of the science of food agriculture，2005， 95: 286-292.

［20]Zhou ZH， Zhang YJ， Xu M， et al. Puerins A and B， two new 8-C substituted flavan-3-ols from Pu-er tea ［J］. J Agric Food Chem， 2005， 53（22）: 8614-8617.

［21]Yang DJ， Hwang LS. Study on the conversion of three natural statins from lactone forms to their corresponding hydroxy acid forms and their determination in Pu-Erh tea ［J］. J Chromatogr A， 2006， 1119（1/2）: 277-284.

［22]吕海鹏， 林智， 谷记平， 等. 普洱茶中的没食子酸研究［J］.茶叶科学， 2007， 27（2）: 104-110.

［23]Lv H， Zhu Y， Tan J， et al. Bioactive compounds from Pu-erh tea with therapy for hyperlipidaemia ［J］. Journal of Functional Foods， 2015， 19: 194-203.

［24]吕海鹏， 谷记平， 林智， 等. 普洱茶的化学成分及生物活性研究进展［J］. 茶叶科学， 2007， 27（1）: 8-18.

［25]东方， 杨子银， 何普明， 等. 普洱茶抗氧化活性成分的LC-MS分析［J］. 中国食品学报， 2008， 8（2）:133-141.

中图分类号：TS272.5+4；R972+.6

文献标识码：A

文章编号：1000-369X（2016）03-237-08

收稿日期：2015-12-21

修订日期：2016-01-25

基金项目：中医药重点研究计划（2012ZZ011）

作者简介：朱晟易，男，硕士研究生，主要从事非酒精性脂肪性肝病早期预防和治疗的研究。*通讯作者：songzy@medmail.com.cn

Effect of Pu-erh Tea on Long Chain Fatty Acid Metabolism and Expression of Tight Junction Proteins in the Rat Model of Non-alcoholic Fatty Liver Disease

ZHU Shengyi1， TONG Yuling1， ZHAO Yi1， LÜ Haipeng2， LIN Zhi2，SHEN Guoli1， SUN Ting1， SONG Zhenya1*
1. The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University， School of Medicine， Hangzhou 310009， China；2. Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization of Ministry of Agriculture， Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008， China

Abstract:In this study， the influence of Pu-erh tea on the absorption of long chain fatty acids in non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD） rats was analyzed. Moreover， the possible interventional mechanism was also discussed. Thirty-six SD rats were randomly divided into three groups， normal group （NG）， NAFLD group， and Pu-erh tea group （PTG）， 12 rats for each group. All rats were killed after 8 weeks. Rat weight， liver index， serum lipid level，intestinal lipid absorption protein （CD36）， tight junction proteins （Occludin， ZO-1）， and TNF-α mRNA were measured.Compared with NAFLD group， rat weight and serum LDL-C in PTG were decreased by 16.12% and 42.59%， respectively. In addition， the expressions of CD36 and TNF-α mRNA in PTG were decreased， while occludin and ZO-1 mRNA expressions were increased. Our results suggest that Pu-erh tea can regulate the intestinal absorption of long chain fatty acids and the tight junction proteins in rats， and it is especially effective in prophylaxis against ‘the first attack’in the early stage of NAFLD.

Keywords:Pu-erh tea， nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD）， lipid metabolism， tight junction