长期应用地西泮对豚鼠耳蜗微音器电位的影响

王立友，李　姗，王　芳，柴玲姗，刘永江，熊顺华

(1.湖北医药学院临床医学专业，十堰　442000；2.湖北医药学院生理学教研室，十堰　442000)



·药理·

长期应用地西泮对豚鼠耳蜗微音器电位的影响

王立友1，李姗1，王芳1，柴玲姗1，刘永江1，熊顺华2*

(1.湖北医药学院临床医学专业，十堰442000；2.湖北医药学院生理学教研室，十堰442000)

摘要：目的观察长期应用地西泮对豚鼠耳蜗微音器电位的影响。方法采用逐渐增加剂量的方法皮下注射地西泮3个月后停药，10 d后用不同强度的短声刺激诱发微音器电位产生，测量诱发微音器电位产生的阈值，用共聚焦显微镜测量耳蜗毛细胞内Ca2+浓度的变化。结果应用地西泮3个月后停药，与对照组相比，引起豚鼠微音器电位产生的阈值明显降低，微音器电位的幅度显著增加，记录出自发的微音器电位，毛细胞内Ca2+浓度降低。结论长期应用地西泮后豚鼠耳蜗对声刺激的敏感性增加可能与毛细胞内Ca2+浓度降低有关。

关键词：地西泮；长期应用；耳蜗；微音器电位

1仪器与材料

1.1仪器BL-420生物信号采集系统(成都泰盟科技有限公司)；共聚焦显微镜(LSM 510 META，德国蔡氏集团)。

1.2试药Fluo-4AM(DojinDo Laboratories东仁化学科技上海有限公司)；地西泮(天津金耀药业有限公司，批号1403181，5 mg·mL-1)；人工外淋巴液(mmol·L-1)的配制:氯化钠溶液137 mmol·L-1，氯化钾溶液5.4 mmol·L-1，氯化镁溶液1.8 mmol·L-1，氯化钙溶液1.3 mmol·L-1，N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES)5.0 mmol·L-1，葡萄糖(Glucose)5.0 mmol·L-1，用氢氧化钠溶液调节pH值至7.3。

1.3动物约150 g的豚鼠40只(实验动物质量合格证SCXK(鄂)2011-0011)。动物实验在湖北医药学院实验动物中心完成，实验动物设施使用证明SYXK(鄂)2011-0031。

2方法

2.1地西泮成瘾模型的构建选取豚鼠40只，实验组20只，对照组20只，实验组采用逐渐增加剂量的方法皮下注射地西泮，首剂0.2 mL，致使豚鼠在10～20 min内呈安静睡眠状态，2 d给药1次，每个剂量注射5次后增加0.05 mL，直至剂量增至0.55 mL，在用药80 d时开始逐渐减量，每次减0.1 mL，每个剂量应用1次，减至0.2 mL时停药;对照组皮下注射同等剂量的生理盐水，停药10～15 d时进行微音器电位的记录和引发微音器电位阈值的测量。

2.2耳蜗微音器电位记录和听阈的测量每100 g豚鼠腹腔注射质量浓度为100 g·L-1的氨基甲酸乙酯0.5 mL以麻醉豚鼠，剪去一侧耳廓后面的毛，用咬骨剪剪开耳廓后面的乳突即可见圆窗，将1根电极置于圆窗或其附近，另一电极置于皮下，信号送入BL-420信号采集系统进行记录，将不同强度的电压信号输入话筒给出短声刺激以诱发耳蜗微音器电位，每一个单刺激时间为2 ms，刺激强度从最小的0.01 V开始逐渐增加，致话筒发出的声音逐渐增大，以引发出不同幅度的电位，当声音增加至某一强度时刚好记录到微音器电位，即为听阈。在保持周围环境安静的情况下连续记录1 h以观察能否记录出自发产生的微音器电位。

2.3共聚焦显微镜测量细胞内Ca2+取30 μL的二甲基亚枫加入装有50 μg Fluo-4AM粉末的EP管中，使其溶解并充分混匀，取已经溶解的含有Fluo-4AM的混合物1 μL，加入100 μL人工外淋巴液将其稀释。取停药10～15 d的豚鼠，击昏，去头取耳蜗，置于人工外淋巴液中，用吸管吹打，使毛细胞脱离耳蜗壁至外淋巴液中，取已经分离的耳蜗毛细胞置于96孔板中，静置10 min后，尽可能地吸去外淋巴液，在含有毛细胞的培养板中加入已经稀释了的含Fluo-4AM的外淋巴液,10 μL/孔，放入培养箱中，整个过程要注意避光，20 min后取出,放于共聚焦显微镜上进行检测，激发波长为488 nm。

3结果3.1应用地西泮3个月后耳蜗微音器电位的变化应用地西泮3个月后停药，与对照组相比，刺激诱发的耳蜗微音器电位产生的阈值明显降低，微音器电位的幅度显著增加，在没有声音刺激的环境下连续记录1 h，对照组没有记录出自发产生的微音器电位，在地西泮组，10个豚鼠中有3个记录出自发的微音器电位，见表1和图1。

表1地西泮成瘾后豚鼠微音器电位的变化

Tab.1 Changes of the microphonic potentials after diazepam addiction in guinea pigs

(n=10)

注：*P<0.05。

图1刺激诱发和自发产生的微音器电位

A.对照组;B.实验组;C.刺激诱发的微音器电位;D.自发产生的微音器电位

Fig.1 The evoked and spontaneous microphonic potential

A.control group;B.diazepam group;C.microphonic potential evoked by stimulation;D.spontaneous microphonic potential

由图1可知，箭头所示为自发产生的微音器电位，用刺激诱发对照组和实验组的微音器电位幅度随刺激强度而发生变化。

3.2应用地西泮3个月后耳蜗毛细胞内Ca2+浓度的变化细胞内游离Ca2+浓度的高低可用细胞内荧光强度表示，激光共聚焦显微镜可实时记录荧光强度；与对照组相比，地西泮组毛细胞浆中荧光强度和光密度值(对照组 3 475.00±801.79，实验组2 324.90±701.17，P<0.05)显著降低，Ca2+浓度显著低于对照组。见图2。

图2耳蜗外毛细胞内Ca2+浓度的变化

A.对照组;B.地西泮组

Fig.2 Changes of Ca2+concentration in the outer hair cells of the cochlea

A.control group;B.diazepam group

4讨论

当声波使基底膜产生机械运动时，毛细胞与盖膜的相对位置变化形成剪力使静纤毛倾斜，通过“弹簧门控作用”使静纤毛顶部阳离子通道开放，阳离子内流导致膜电位发生去极化；毛细胞的去极化使细胞膜上的电压依赖性Ca2+通道开放，Ca2+流入胞内，胞内Ca2+浓度升高使细胞侧膜上的Ca2+激活，K+通道开放，大量K+外流，毛细胞复极化，同时产生感受器电位和微音器电位，使听神经的传入纤维兴奋并发放冲动，引起听觉的形成。结果显示，不同强度的声音刺激耳蜗，诱发的微音器电位幅度与声刺激强度成正比；与对照组相比，长期应用地西泮停药后，引发微音器电位产生的刺激阈值降低，同等强度声刺激诱发的微音器电位幅度增大，提示豚鼠耳蜗对声音的敏感性增加，且在没有声音刺激时还记录到自发产生的微音器电位，提示长期大量应用地西泮后出现的听觉过敏和幻听可能与耳蜗功能活动的变化有关。由图2可知，长期大量应用地西泮后，毛细胞内Ca2+浓度显著低于对照组；Ca2+通过非选择性阳离子通道、L型Ca2+通道和N型Ca2+通道进入毛细胞内，Ca2+入胞增大了细胞的去极化，增强了听觉的产生；但细胞内Ca2+浓度的增加，促进了K+外流、细胞的复极化过程以及听觉的抑制和中止。在内耳，Ca2+参与了耳蜗毛细胞的机械转导、适应、调谐、受体电位的形成和神经递质的释放等多种细胞活动；耳蜗内Ca2+浓度的稳定对正常听觉的形成至关重要，而胞内Ca2+浓度的升高或降低都影响听觉的形成；有资料显示,过度的声刺激会导致耳蜗微音器电位振幅下降，并伴有外毛细胞胞内Ca2+浓度不断升高，两者具有负相关性[10-11]。进一步提示，胞内Ca2+浓度降低与听觉的敏感性增强有关。耳蜗毛细胞上表达GABA受体[12]，地西泮可作用于GABA受体，打开Cl-通道，Cl-内流使膜电位下降，影响L和N型Ca2+通道的开放，使Ca2+内流减少。听觉的敏感性增强或幻听的产生可能与地西泮致胞内Ca2+浓度的降低导致听觉的抑制和中止过程减弱有关，其对耳蜗的影响还有待进一步探讨。

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基金项目：湖北省大学生创新训练计划项目(编号:2014109 29021)

作者简介：王立友，男，在读本科生

*通信作者：熊顺华，女，教授

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.018

中图分类号：R965

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)04-0386-03

(收稿日期：2015-09-10)

Effect of long-term application of diazepam on cochlea microphonic potential in guinea pig

WANG Liyou1，LI Shan1，WANG Fang1，CHAI Lingshan1，LIU Yongjiang1，XIONG Shunhua2*

(1.Clinical Medicine Specialty，Hubei Medical College,Shiyan 442000，China；2.Department of Physiology，Hubei Medical College，Shiyan 442000，China)

Abstract:Objective To investigate the effect of long term usage in diazepam on the microphonic potential in guinea pigs.Methods Diazepam with progressively higher doses was injected into the subcutaneous of guinea pigs for 3 months. The microphonic potential was induced by short blast under different intensities after 10 days.Then the thresholds of microphonic potential were measured and changes of Ca2+concentration in cochlea hair cells were determined by laser scanning confocal microscope.Results Compared with the control group，the threshold value of stimulation induced microphonic potential was significantly decreased，while the amplitude was significantly increased.The spontaneous microphonic potential was recorded，and Ca2+concentration in cochlea hair cell of guinea pig was reduced in diazepam group.Conclusion The sensitivity of guinea pig cochlea to acoustic stimulation may be related to the decrease of Ca2+concentration in hair cells after long-term use of diazepam.

Key words：diazepam；long-term application；the cochlear；microphonic potential