黑果枸杞精油成分提取及体外抗氧化性研究

赵秀玲，李坤

(黄山学院生命与环境科学学院，安徽 黄山 245021)



黑果枸杞精油成分提取及体外抗氧化性研究

赵秀玲，李坤

(黄山学院生命与环境科学学院，安徽 黄山 245021)

摘 要：以黑果枸杞为材料，采用水蒸气蒸馏法提取黑果枸杞精油，利用GC–MS法对精油成分进行分离和鉴定，并以抗坏血酸(V–C)为阳性对照，以DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基的清除率为评价指标，研究黑果枸杞精油的体外抗氧化性。结果表明：从黑果枸杞精油中共鉴定分离出了38种化合物，主要成分为亚油酸、棕榈酸、反油酸，2，3–二氢苯并呋喃、亚油酸甲酯、2–甲氧基–4–乙烯基苯酚，以有机酸类和酯类为主(占85.696%)；抗氧化性研究结果显示，黑果枸杞精油对DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基清除的半抑制浓度(IC50)分别为0.002 21、0.007 68、0.000 09 µg/µL。

关 键 词：黑果枸杞；精油；气相色谱–质谱联用；化学成分；抗氧化性

黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)为茄科枸杞属植物，主要分布于中国、巴基斯坦、印度等国家。中国主要分布于西北地区，如宁夏、新疆、西藏、青海、内蒙、甘肃等地。黑果枸杞味甘、性平、清心热，果实在传统中药中被用来治疗心脏病，月经异常及停经等[1]；民间用于滋补强壮，明目及降压等[2]。果实中含有精油[3]、多糖、色素和黄酮等活性成分，还含有氨基酸、维生素、矿物质和微量元素[4]。植物精油具有防腐、抗氧化、抑菌、杀虫等多种活性。不同植物的精油效用及应用前景被人们逐一挖掘[5]。目前，国内外对黑果枸杞的研究大多是多糖、黄酮、花色苷等化学成分的提取研究，但对其精油的化学组成及其抗氧化性的研究鲜见报道。本试验以黑果枸杞为试材，采用水蒸气蒸馏法提取精油，并测定了黑果枸杞精油对DPPH自由基、ABTS自由基和羟自由基3种自由的清除率，旨在为黑果枸杞中精油的高效利用和开发新型抗氧化类保健食品提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

供试黑果枸杞产自青海格尔木诺木洪。

1,1–二苯基–2–苦肼基(DPPH)，上海士锋科技有限公司产品；2,2–联氮基–双–(3–乙基苯并噻唑啉–6–磺酸)–二氨盐(ABTS)，上海华蓝化学科技有限公司产品；V–C(抗坏血酸)、无水乙醚、FeSO4溶液、H2O2、水杨酸、过硫酸钾、无水硫酸钠等均为国产，分析纯。

1.2仪器与设备

UV754N紫外可见光光度计，上海成光仪器厂产品；Agilent HP7890–5975C气相色谱–质谱联用仪，美国Agilent公司产品；精油提取器，北京亚欧德鹏科技有限公司产品；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂产品。

1.3方法

1.3.1黑果枸杞精油的提取

黑果枸杞粉碎，过孔径为0.175 mm的筛，备用。

准确称取黑果枸杞粉末20 g，置于500 mL精油提取器中，加入300 mL蒸馏水，加热至微沸，收集精油6 h，往收集好的精油中加入一定量的无水硫酸钠，静置过夜，过滤，滤渣用无水乙醚洗涤，合并滤液，旋转蒸发仪除去精油中的乙醚，得黑果枸杞脱水精油，备用。

1.3.2黑果枸杞精油成分检测

该矿区内无大的河流,沟谷发育,沟溪水枯季流量小或干枯,雨后山间沟溪水流量较大，受降雨控制明显。暴雨后有山洪发生。只有下山河从矿区南部流过，本次调查测流量为最大86 L/s。

采用Agilent HP7890–5975C气相色谱–质谱联用仪对提取的精油进行主成分检测。色谱柱为HP–5MS，石英毛细管(0.25 μm，30 m×0.25 mm)。升温程序为：40 ℃保持3 min，4 ℃/min升温到160℃，保持3 min，6 ℃/min升到290 ℃，保持10 min。载气为高纯氦气，体积流量为1.0 mL/min，分流比为30∶1，进样口温度为280 ℃，进样量为0.5 µL。质谱条件为电子轰击(EI)离子源，电子能量为70 eV，溶剂延迟2.2 min，扫描质量数范围(m/z )35～450。

1.3.3黑果枸杞精油抗氧化性的测定

1) DPPH自由基清除作用的测定。参照文献[6]的方法并略作修改，具体操作如下：取一定量提取好的精油，用丙酮稀释至体积分数为20%；分别取稀释好的精油20、40、60、80、100和120 µL置于6支试管，样品体积少于120 µL的试管以丙酮补至120 µL，配制成样品质量浓度梯度分别为0.001 67、0.003 34、0.005 00、0.006 67、0.008 33、0.100 00µg/µL的溶液；分别加入2 mL浓度为60 µmol/mL的DPPH甲醇溶液，摇匀，在黑暗中静置30 min，于517 nm处测定吸光度，记为A1，以甲醇为空白对照，在517 nm处测吸光度，记为A0，以V–C为阳性对照，DPPH自由基清除率(1－A1/A0)。上述试验均重复3次，结果取平均值。

2) 羟基自由基的清除作用测定。参照文献[7]的方法并略作修改，具体操作如下：分别取体积分数为20%的丙酮精油溶液 20、40、60、80、100、120 µL置于6支试管，样品体积少于120 µL的试管用丙酮补至120 µL，配制成样品质量浓度梯度分别为0.001 67、0.003 34、0.005 00、0.006 67、0.008 33、0.100 00 µg/µL的溶液，再往各试管分别加入9 mmol/L FeSO4，9 mmol/L 水杨酸–乙醇溶液2 mL，加入12 mmol/L H2O22 mL，混匀，于37 ℃反应30 min；以去离子水调零，用分光光度计于510 nm处测定吸光度，记为A1；以去离子水代替双氧水重复上述操作，测得精油样品的分光光度值，记为A2；再以水代替精油，测得分光光度值，记为A0；以V–C为阳性对照，羟基自由基清除率(1－(A1－A2)/A0)。上述试验重复3次，结果取平均值。

3) ABTS自由基的清除作用测定。参照文献[8]的方法：取7 mmol/L ABTS+溶液5 mL，加入140 mmol/L过硫酸钾88 µL，混合，在室温避光条件下反应12～16 h，用无水乙醇稀释成在734 nm波长下吸光度为0.7±0.02的溶液；取体积分数为20%丙酮精油样品溶液20、40、60、80、100、120 μL，配制成质量浓度梯度分别为0.001 67、0.003 34、0.005 00、0.006 67、0.008 33、0.100 00 µg/µL的溶液；分别加入2 mL ABTS自由基溶液，6 min后测其吸光度，记为Ai；测定2 mL无水乙醇溶液与不同体积样品的吸光度，记为Aj；测定2 mL ABTS自由基溶液分别与20、40、60、80、100、120 µL无水乙醇混合后的吸光度，记为A0；以V–C为阳性对照。ABTS自由基清除率((A0–Ai+Aj)/A0)。每个试样重复3次，结果取平均值。

1.4数据处理与分析

根据系统分析得到的总离子流图，采用NIST08图谱库检索，鉴定黑果枸杞精油的各种成分；利用峰面积归一化法进行定量分析，计算各化学成分在精油中的相对含量。

2　结果与分析

2.1黑果枸杞精油GC–MS分析结果

黑果枸杞精油所得成分的GC–MS总离子流图见图1；成分分析结果见表1。从黑果枸杞精油中共分离出了72个色谱峰，鉴定出38种化合物，占精油总量的98.684%，包括有机酸类7种(77.16%)，酯类7种(8.536%)，杂环类3种(4.379%)，酚类5 种(3.688%)，醇类4种(3.172%)，醛类4种(1.211%)，烃类5种(0.368%)，酮类(0.126%)，醚1种(0.044%)。主要以有机酸类和酯类为主，杂环类、酚类、醇类、醛类、烃类、酮类和醚成分含量低。

在黑果枸杞精油已鉴定出的成分中，含量高于2.0%的成分有亚油酸(39.185%)，棕榈酸(23.418%)，反油酸(12.153%)，2，3–二氢苯并呋喃(4.242%)，亚油酸甲酯(3.820%)，2–甲氧基–4–2乙烯基苯酚(3.271%)，(9z)–9，17–十八碳二烯醇(2.372%)。这7种主要成分占精油总量的88.462%，包括3种酸类、3种杂环类、1种酯类、1种酚类和1种醇类。

图1　黑果枸杞精油的GC–MS总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile oils from Lycium ruthenicum

表1　黑果枸杞精油的GC–MS分析结果Table 1　Results on GC–MS analysis of volatile oils from Lycium ruthenicum

2.2 黑果枸杞精油的抗氧化性

2.2.1黑果枸杞对DPPH自由基的清除作用

试验结果表明，随着黑果枸杞精油质量浓度的增加，清除率逐渐增大，精油质量浓度(x)与清除率(y)的回归方程为y =6 983.9x+34.556(R2=0.909 )，相关性达极显著水平，IC50(清除率为50%时样品的浓度)为0.002 21 µg/µL；V–C质量浓度(x)与清除率(y)的回归方程为y =8 840.4x+16.925(R2=0.822 1)，对照品V–C的 IC50为0.003 74 µg/µL 。

2.2.2黑果枸杞精油对羟基自由基的清除作用

试验结果表明，随着浓度的升高，对羟基自由基的清除率也随着增大，当黑果枸杞精油质量浓度为1.0 µg/µL时，清除能力达62.65%，精油质量浓度(x)与清除率(y)的回归方程y =6 852.7x- 2.625 (R2=0.963)；V–C质量浓度(x)与清除率(y)的回归方程y =7 982.3x+18.59 8(R2=0.856)。黑果枸杞精油和V–C的IC50分别为0.007 68 和0.003 94 µg/µL。

2.2.3黑果枸杞对ABTS自由基的清除作用

试验结果表明，随着黑果枸杞精油质量浓度的增加，对ABTS的清除作用也逐渐增强，两者存在一定的线性关系，精油质量浓度(x)与清除率(y)的回归方程y =4 511.2x+49.591(R2=0.911 5)；V–C质量浓度(x)与清除率(y)的回归方程为y =7 907.8x+ 17.036（R2=0.860 7 )；黑果枸杞精油和V–C的IC50分别为0.000 09和0.004 17 µg/µL。

3　结论

本试验从黑果枸杞精油中分离鉴定出38种化合物，含有脂肪酸类、酯类、杂环类、酚类、醇类、醛类等成分，其中以有机酸和酯类为主，占85.696%。黑果枸杞精油中含有多种在食品、医药、化工等方面有重要用途的物质，如亚油酸，棕榈酸，反油酸，2，3–二氢苯并呋喃等。抗氧化性试验结果表明，黑果枸杞精油具有较好的体外抗氧化性能，在一定的质量浓度范围内，对DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基的IC50分别为0.002 21，0.007 68和0.000 09 µg/µL，且呈现一定的量效关系。

参考文献：

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责任编辑：尹小红英文编辑：梁 和

Composition of Lycium ruthenicum and its antioxidation in vitro

Zhao Xiuling, Li Kun
(School of Life and Environment Sciences, Huangshan College, Huangshan, An’hui 245021, China)

Abstract:Volatile oil from Lycium ruthenicum was extracted by steam distillation and its antioxidant activities in vitro were evaluated by scavenging capacity against DPPH free radical, hydroxyl free radical and ABTS free radical, with ascorbic acid (V–C) as the positive control. Then the chemical constituent of the volatile oil were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC–MS). The results showed that: 38 components were isolated and identified from the volatile oil. The main compounds in the volatile oils were linolic acid, Palmitic acid, elaidic acid, 2,3-dihydrobenzofuran, methyl linoleate, 2-methoxy-4-vinyphonol. The acids and esters were the dominant components in the essential oils(which occupied 85.696% of total constituents); the IC50value of scavenging against DPPH free radical, hydroxyl free radical and ABTS free radical were 0.002 21, 0.007 68, 0.000 09 µg/µL, respectively. The antioxidation of volatile oils in vitro had a relation of concentration-dependent.

Keywords:Lycium ruthenicum; volatile oil; gas chromatography-mass spectrometry; chemical constituents; antioxidant

中图分类号：S567.1+9

文献标志码：A

文章编号：1007−1032(2016)02−0193−04投稿网址：http://xb.ijournal.cn

收稿日期：2015–09–28 修回日期： 2016–03–10

基金项目：安徽省教育厅项目(KJHS2015B03)；安徽省大学生创新创业计划项目(AH2014103753122)；黄山学院科研项目(2013XKJ002)

作者简介：赵秀玲(1973—)，女，新疆奇台人，硕士，讲师，主要从事食品功能性研究，zhaoxiuling2008ren@aliyun.com