高效液相色谱法与全自动免疫比浊法测定HbA1c的临床应用研究

张超强赖春苗张力球巫广平吴国平



高效液相色谱法与全自动免疫比浊法测定HbA1c的临床应用研究

张超强①赖春苗①张力球①巫广平①吴国平①

【摘要】目的：探讨高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）与全自动免疫比浊法（immunoturbidimetry，ITM）测定糖化血红蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）的临床应用。方法：选取2014年1月-2015年1月河源市龙川县人民医院内分泌科糖尿病患者115例（研究组）与体检中心健康体检者115例（对照组），全部研究对象均采用HPLC、ITM测定HbA1c水平，比较两组HbA1c水平的差异，并分析两种检测方法的数据有效性、相关性、偏差与精密度的差异。结果：经Bland-Altman相对偏倚散点图显示，全部测量数据均在95%可置信区间（0.60，1.00）内，全部测量数据有效。研究组HbA1c水平均明显高于对照组（P＜0.05），其中随着HbA1c水平的降低，糖尿病并发症发生率显著降低，不同HbA1c水平的糖尿病并发症发生率比较差异有显著性（P＜0.05）。线性回归分析显示，HPLC与ITM检测方法具有明显的相关性（R2=0.9993）。偏差分析显示，低、中、高值（HbA1c=4.0%～6.4%，6.5%～15.9%、16.0%）预测相对偏差均属于可接受范围。批内与批间精密度比较显示，研究组变异系数（CV）明显高于对照组（P＜0.05），而HPLC法的CV较低。结论：高效液相色谱法用于测定HbA1c与评估糖尿病并发症发生风险中具有重要的意义，且其与ITM具有良好的相关性，准确度与精密度均较高，可作为临床参考标准。

【关键词】高效液相色谱法； 全自动免疫比浊法； HbA1c

①广东省龙川县人民医院 广东 龙川 517300

First-author’s address：Longchuan County People’s Hospital，Longchuan 517300，China

糖化血红蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）在糖尿病初步筛查与诊断中具有明显的优势［1］。本研究通过比较高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）与全自动免疫比浊法（immunoturbidimetry，ITM）测定HbA1c的优劣势，旨在提高HbA1c对糖尿病的诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月-2015年1月本院内分泌科住院部的115例糖尿病患者作为研究组，全部患者均符合糖尿病的确诊标准［2］。同期选取本院健康体检中心的115例健康体检者作为对照组。研究组：男50例，女55例，年龄35～55岁，平均（43.02±6.25）岁；对照组：男52例，女53例，年龄34～58岁，平均（42.98±6.31）岁。两组研究对象性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法 （1）检测仪器与试剂：高效液相色谱仪（VARIANT Ⅱ，美国伯乐公司），试剂采用原厂配套试剂。全自动免疫比浊检测仪（AU2700全自动生化分析仪，美国贝克曼公司），全自动免疫比浊试剂盒（广州科方生物技术有限公司）。（2）检测步骤：全部研究对象均采用一次性EDTA-K2真空抗凝管采集静脉全血，标本采集严格按照仪器说明书操作，冷冻保存待测。严格按照试剂盒说明书在高效液相色谱分析仪与全自动生化分析仪上，准确设定相关参数，检测标本HbA1c水平。（3）质量控制：每份标本测定时同时测定2个质控品，分别采用高效液相色谱法与全自动免疫比浊法测定，每天测定的23份标本，按照正向顺序1→23测定1次，再按照反向顺序23→1重复测定1次，连续10 d，共230份标本。

1.3 观察指标

1.3.1 有效性分析 以同份标本的平均HbA1c水平作为横坐标，同份标本的比值（检测样本/参照样本）作为纵坐标，绘制Bland-Altman相对偏倚散点图，观察离群点是否在95%可置信区间内，如全部测量数据均位于95%可置信区间内，如无需剔除离群点，则提示全部测量数据有效［3］。

1.3.2 HbA1c水平 比较两组患者HbA1c水平的差异，分析不同HbA1c水平与糖尿病并发症发生率的关系。

1.3.3 相关性分析 采用线性回归分析高效液相色谱法与全自动免疫比浊法两种测定方法的相关性。以HPLC检测方法测定值作为横坐标（X），ITM检测方法测定值作为纵坐标（Y），计算直线回归方程［4］。

1.3.4 偏差分析 以HbA1c=4.0%～6.4%作为低值，HbA1c=6.5%～15.9%作为中值，HbA1c≥16.0%作为高值，以2014年广东省临床检验中心临床化学质量控制允许偏倚范围的1/2（7.5%），计算低值、中值、高值的预测相对偏差与总误差的差值，如总误差-预测相对偏差＞0，则属于可接受范围，反之，总误差-预测相对偏差＜0，则属于不可接受范围［5］。

1.3.5 精密度分析 采用重复性试验，计算平均HbA1c水平与变异系数（coefficient of variation，CV），CV越小，其重复性越佳，CV＜5.0%则提示具有良好的重复性［6］。（1）批内精密度：任意取研究组与对照组标本各1份，1 d内同时测定20次。（2）批间精密度：任意取研究组与对照组标本各1份，冰冻保存，每天测定1次，连续20 d。

1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料（±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 X2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种检测方法的测量数据有效性分析 本研究230份标本（230组数据）中，经Bland-Altman相对偏倚散点图（图1）显示，95%可置信区间为（0.60，1.00），全部测量数据均在95%可置信区间内，无需剔除离群点，全部测量数据有效。

图1 230份标本检测结果Bland-Altman相对偏倚散点图

2.2 两组患者HbA1c水平比较 研究组HPLC、ITM检测的HbA1c水平均明显高于对照组，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），详见表1。

表1 两组患者HbA1c水平比较（±s） %

表1 两组患者HbA1c水平比较（±s） %

组别　HbA1c（HPLC）　HbA1c（ITM）研究组（n=115）　11.26±0.25　11.27±0.27对照组（n=115）　5.16±0.17　5.17±0.18 t值　4.15　4.17 P值　　＜0.05　　＜0.05

2.3 不同HbA1c水平糖尿病患者并发症发生情况比较 HPLC、ITM检测结果显示：HbA1c＜6.5%糖尿病并发症发生率明显低于HbA1c=6.5%～9.0%、HbA1c＞9.0%，HbA1c=6.5%～9.0%糖尿病并发症发生率明显低于HbA1c＞9.0%，不同HbA1c水平糖尿病并发症发生率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表2。

表2 不同HbA1c水平糖尿病患者并发症发生情况比较 例（%）

2.4 两种检测方法相关性分析 根据HPLC与ITM检测HbA1c水平（%）的线性回归分析图，直线回归方程为Y=0.09901X+0.07，R2=0.9993，HPLC与ITM检测方法具有明显的相关性。

2.5 两种检测方法的偏差分析 两种检测方法的偏差分析显示，总误差-低值预测相对偏差＞0，总误差-中值预测相对偏差＞0，总误差-高值的预测相对偏差＞0，均属于可接受范围，详见表3。

表3 两种检测方法的偏差分析

2.6 两种检测方法的精密度分析 批内与批间精密度比较显示，研究组HPLC、ITM检测的平均HbA1c水平与CV明显高于对照组，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），其中HPLC检测的CV稍低于ITM，但两者比较差异无统计学意义（P＞0.05），详见表4。

表4 两种检测方法的精密度分析 %

3 讨论

随着生活方式与饮食习惯的改变，糖尿病发生率呈逐年增高的倾向，并成为全球常见的慢性内科疾病之一，严重影响身体健康与生活质量。HbA1c有助于反映糖尿病患者6～8周内的平均血糖水平，且不受胰岛素、空腹、抽血时间与血糖波动等因素的影响。因此，HbA1c在糖尿病的诊断与治疗中具有重要的意义。2010年美国糖尿病协会（American Diabetes Association，ADA） 将 HbA1c≥ 6.5%作为糖尿病的诊断标准，5.7%～6.3%作为糖尿病的高危人群［7］。2011年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）正式采纳HbA1c≥6.5%作为糖尿病的诊断标准［8］。目前，美国糖化血红蛋白标准化计划（AVUP）推荐采用高效液相色谱法（HPLC）作为HbA1c的检测金标准［9］。但HPLC检测方法的硬件条件较高，成本较高，不适用于基层医院的推广应用［10］。全自动免疫比浊法（ITM）操作较为简便，成本较为低廉。但关于HPLC与ITM 在HbA1c中的测定价值研究罕见。

本研究结果显示，经Bland-Altman相对偏倚散点图显示，全部测量数据均在95%可置信区间（0.60，1.00）内，全部测量数据有效。同时，糖尿病患者HbA1c水平均明显高于健康体检者，其中随着HbA1c水平的降低，糖尿病并发症发生率显著降低，不同HbA1c水平糖尿病患者并发症率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。揭示了HbA1c水平在糖尿病的诊断与糖尿病并发症的预测中具有重要的价值。由于HbA1c是血糖与机体血红蛋白相结合的产物，HbA1c水平与血糖浓度具有明显的正相关，且HbA1c维持时间约为120 d，临床上可将HbA1c作为糖尿病患者8～12周的血糖控制指标［11］。同时，由于HbA1c生成较为缓慢，性质较为稳定，不容易受短期血糖波动的影响。与空腹血糖、口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）相比，HbA1c检测较为简便，稳定变异性较低，依从性高，因此可作为糖尿病患者有效的筛查指标［12］。结合本研究结果，HbA1c水平越高，其糖尿病并发症发生率越高，因此测定HbA1c水平有助于准确预测糖尿病肾病、糖尿病性视网膜病变与糖尿病性动脉粥样硬化等糖尿病并发症的发生风险。文献［13］证实，HbA1c水平≤7.0%有助于控制糖尿病周围神经血管病变的发生风险。线性回归分析显示，HPLC与ITM检测方法具有明显的相关性（R2=0.9993）。偏差分析显示，低、中、高值（HbA1c=4.0%～6.4%，6.5%～15.9%、16.0%）预测相对偏差均属于可接受范围。批内与批间精密度比较显示，糖尿病患者变异系数（CV）明显高于健康体检者，而HPLC法的CV较低。HPLC经重复性试验显示，糖尿病患者批内CV（3.2%），批间CV（4.1%），均低于5.0%，符合临床检验要求，提示HPLC具有的检测重复性较高［14］。糖尿病患者ITM的批内CV（3.9%），批间CV（4.6%），与HPLC具有明显的相关性（R2=0.9993），且预测相对偏差位于可接受范围之内，与文献［15］的报道结果相一致。

综上所述，高效液相色谱法用于测定HbA1c与评估糖尿病并发症发生风险中具有重要的意义，且其与ITM具有良好的相关性，准确度与精密度均较高，可作为临床参考标准。

参考文献

［1］符眷苗，胡耀华，吴翔.不同年龄层次糖尿病患者糖化血红蛋白诊断标准研究［J］.中国现代医学杂志，2015，25（8）：59-62.

［2］王毅方，黄辉，彭责成，等.空腹血糖、糖负荷后2h血糖和HbA1c对糖尿病的诊断价值［J］.中华内分泌代谢杂志，2015，31（5）：443-446.

［3］周保卫.竞争性透射免疫比浊法和高效液相色谱法分别测定糖尿病者糖化血红蛋白的结果分析［J］.吉林医学，2014，35 （12）：2529-2530.

［4］黄青，陆益红，史清水.高效液相色谱法测定缩宫素注射剂含量及其与生物效价测定法比较和应用［J］.药物分析杂志，2015，35（6）：1115-1121.

［5］杨石，秦雪，李山，等.血清降钙素原2种检测系统测定结果可比性及相对偏差评估［J］.临床检验杂志，2014，32（1）：67-68.

［6］张传宝，闫颖，赵海舰，等.对4个HbA1c测定系统的精密度和正确度验证［J］.中国糖尿病杂志，2011，19（11）：805-808.

［7］ Menon A S，Ahluwalia A I.The ABC of diabetes. How many patients are able to achieve the goal laid down by American Diabetes Association［J］.Medical Journal Armed Forces India，2015， 71（2）：132-134.

［8］ Dubose S N，Hermann J M，Tamborlane W V，et al.Obesity in youth with type 1 diabetes in Germany，Austria，and the United States［J］.Journal of Pediatrics，2015，167（3）：627-632.

［9］夏蔚珉.不同干扰物对酶法和高效液相色谱法（HPLC）检测HbA1c的影响［J］.医学检验与临床，2013，25（1）：55-58.

［10］童华诚，刘慧.三种检测系统测定糖化血红蛋白相关性分析及偏倚评估［J］.中国实验诊断学，2011，15（7）：1156-1158.

［11］周睿，高志琪，童清.改善糖化血红蛋白床旁检测一致性的新方法［J］.中华检验医学杂志，2015，40（5）：310-312.

［12］王彦文，李军.不同界点糖化血红蛋白水平与胰岛β细胞功能的相关性研究［J］.中国糖尿病杂志，2015，23（4）：349-352.

［13］张会峰.2型糖尿病血糖控制与血小板活性的关系［J］.中国老年学杂志，2014，33（16）：4450-4452.

［14］陈同庆，周春，陈文清，等.酶法测定糖化血红蛋白的方法评价及标本前处理对结果的影响［J］.重庆医学，2015，44 （10）：1374-1377.

［15］温冬梅，张秀明，吴剑杨，等.新鲜全血赋值传递实现不同HbA1c检测系统测定结果的溯源性和可比性［J］.临床检验杂志，2014，32（10）：790-792.

Clinical Application Research on High Performance Liquid Chromatography and Immunoturbidimetry for HbA1c Determination

ZHANG Chao-qiang，LAI Chun-miao，ZHANG Liqiu，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（12）：035-038

【Abstract】Objective：To investigate the clinical application of on high performance liquid chromatography （HPLC） and immunoturbidimetry（ITM） for hemoglobin A1c（HbA1c） determination.Method：From January2014 to January 2015 in Longchuan County People’s Hospital，115 cases diabetes patients from Endocrinology Department were selected as the study group，115 cases healthy people from Health Examination Center were selected as the control group，HbA1c levels of all subjects were determined by HPLC，ITM，HbA1c levels of two groups were compared，the differences of data validity，correlation，deviation and precision between two determinations were analyzed. Result： All data were measured by Bland-Altman relative bias，all data in 95% confidence interval（0.60，1.00），all data were validity.HbA1c levels of the study group were significantly higher than those of the control group（P＜0.05），with the decrease of HbA1c level，the incidence rate of diabetes complications were significantly lower，and the difference of the incidence rate of diabetes was significant in different HbA1c levels（P＜0.05）.Linear regression analysis showed，HPLC and ITM detection were significantly correlated（R2=0.9993）.Deviation analysis showed，relative deviation of low，medium and high values （HbA1c=4.0%-6.4%，6.5%-15.9%，16.0%） were acceptable.Compared with the intra assay and inter assay，variation coefficient（CV） of the study group was significantly higher than that of the control group（P＜0.05），and CV of HPLC was lower.Conclusion：High performance liquid chromatography has important significance for HbA1c determination and diabetes complications risk assessment，and it has correlation with ITM，the accuracy and precision of HPLC are higher，it can be used as clinical reference standard.

【Key words】High performance liquid chromatography； Immunoturbidimetry； HbA1c

通信作者：张超强

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.12.010

收稿日期：（2015-11-12） （本文编辑：程旭然）