基于拉曼光谱技术的枇杷果实β-胡萝卜素含量无损测定研究

王 涛，裘正军，张卫正，赵艳茹，何 勇

浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058

基于拉曼光谱技术的枇杷果实β-胡萝卜素含量无损测定研究

王 涛，裘正军*，张卫正，赵艳茹，何 勇

浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058

β-胡萝卜素；枇杷；拉曼光谱；HPLC

引 言

枇杷被誉为“水果皇后”，不但多汁酸甜，口感良好，而且富含类胡萝卜素，是人们喜爱的保健水果。β-胡萝卜素(C40H56)属于类胡萝卜素，是一种橘黄色脂溶性化合物，具有广泛的药用价值。因此果蔬中的β-胡萝卜素含量是衡量果蔬营养价值以及果蔬品质分级的重要指标之一。

传统检测植物内类胡萝卜素的方法主要是薄层层析法和高效液相色谱法(HPLC)。这些方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。无论是薄层层析法还是高效液相色谱法，都需要长时间的样品准备过程，色素的萃取提纯对操作者的操作要求比较高，分离效果也会因此打折扣。因此，需要寻求一种更为简单、快速的方法对植物体内的类胡萝卜素进行测量。

光谱技术是近年来被广泛研究的快速无损检测技术，其在果蔬检测和品种分类领域也取得了较大的成果。李占龙等利用红外光谱和拉曼光谱对玉米种子成分进行分析，得到了种子不同部位(胚乳、糊粉层、外层)的成分差异[1]，然而却并未定量分析出各组分的含量差异。邹小波等利用近红外高光谱图像对黄瓜叶片色素(叶绿素a，b，β-胡萝卜素)含量进行预测，所有建模方法得到的预测集相关系数Rp均小于0.85[2]。汤旭光等将小波分析引入高光谱数据特征量提取，用于估算大豆叶绿素含量，其反演模型预测Rp最高仅为0.776。由此可见，传统的光谱学方法更多的是应用于果蔬定性分类或分级，在定量分析上总体精度还有待提升。而高光谱虽然可以进行定量，然而光谱信息十分庞大，波段数量多，相比波段相对确定的拉曼光谱，其对数据筛选要求高，这也是其预测模型精度未能进一步提升的原因之一。

拉曼光谱是以拉曼效应为基础建立起来的分子结构表征技术，其信号来源于分子的振动和转动，因此可以很便捷地找到特定物质的频移波段[13]，相比于其他光谱学繁杂的特征波段提取有巨大的优势。其分析方法不需要对样品进行前处理，也没有样品的制备过程，避免了一些误差的产生，并且具有在分析过程中操作简便，测定时间短，灵敏度高等优点。Schulz，Baranska和Baranski介绍了FT-Raman在现场检测植物组织内类胡萝卜素上具有其他方法无法企及的优越性，可以检测到HPLC无法分辨的类胡萝卜素的顺反异构体[3]。

在国内利用拉曼光谱检测活体植物内的有机化合物的研究鲜有报道。本文通过拉曼光谱对枇杷果实进行分析，结合高效液相色谱数据，建立枇杷果实中的β-胡萝卜素的预测模型，实现β-胡萝卜素的定量检测。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

实验中采用的枇杷果实样本为杭州塘栖“红毛丫头”，样本采集时间分别为2014年的4月28日、5月8日和5月16日三个时间段，相对应为枇杷果实未成熟阶段、成熟初期阶段以及完全成熟阶段。每批样本30个，共获取90个样本。将样本置于4 ℃冰箱内保存，在实验前2小时取出置于室温条件下。

实验采用的拉曼光谱仪为Ocean Optics公司的QE65pro采集枇杷果实的拉曼光谱，该仪器的基础参数包括激光波长： 785 nm；像素总数： 1 044×64；检测波长： 779.3～1 148.1 nm；光栅常数： H14；狭缝宽度： 50 μm。

采用高效液相色谱仪获得枇杷果实的β-胡萝卜素含量参考值，型号为岛津公司的LC-20AD型液相色谱仪。实验用化学试剂： 石油醚(沸程30～60 ℃)、甲醇(色谱纯，分析纯)、丙酮(分析纯)、乙腈(色谱纯)、三氯甲烷。所有提取液均置于-18 ℃冷冻避光保存。

β-胡萝卜素标准样品购自Sigma-aldrich公司，纯度大于95%。用于提取拉曼光谱特征频移，并为HPLC提供标准曲线取样点。

1.2 拉曼光谱数据

设置拉曼光谱激发波长为785 nm，TEC温度为-20 ℃，积分时间为5 s，平均次数2次，平滑度为3。将激光发射器置于暗箱内，待拉曼光谱稳定后，开始采集数据。首先测光谱仪暗场光谱并保存，扣除暗场背景后，为了减少随机误差，取枇杷果实样本中心位置附近两个受测点作为采样点。以两个采样点均值表征该样本的拉曼光谱，所有光谱数据均进行了高斯平滑预处理，滤波器宽度为3。

对三个成熟阶段的样本分别进行拉曼光谱的采集。每个样本经过表面干燥、去柄、编号、称量、测直径等预处理后，进行拉曼光谱的测量。获取完拉曼光谱之后，用高效液相色谱仪对样本进行β-胡萝卜素的含量测定。

1.3 高效液相色谱

高效液相色谱法测量β-胡萝卜素是标准公认的检测方法。先利用HPLC对不同梯度浓度的β-胡萝卜素标准溶液进行分析，得到β-胡萝卜素浓度标准曲线。然后通过HPLC对枇杷果实样品提取液进行分析，并比对β-胡萝卜素浓度标准曲线以获得对应样品中β-胡萝卜素含量的参考值。

精确称取β-胡萝卜素标准品12.5 mg于烧杯中，先用少量三氯甲烷溶解，再用石油醚溶解并洗涤烧杯数次，溶液转入50 mL容量瓶中，用石油醚定容，浓度为250 μg·mL-1，置于-18 ℃储存备用。根据所需浓度取一定量的β-胡萝卜素标准液用甲醇稀释为100 μg·mL-1。β-胡萝卜素在开始着色期间，含量都较低，因此稀释标准溶液浓度至0.1，0.5，1 μg·mL-1。

枇杷果实中β-胡萝卜素提取液的制备过程参考国标GB T 5009.83 2003。将所获提取液置于-18 ℃保存，次日将样本进行高效液相分析。高效液相分析参数，色谱柱： Spherisorb C18柱4.6 mm×150 mm；流动相： 甲醇+乙腈(90+10)；流速： 1.2 mL·min-1；波长： 448 nm；进样量： 10 μL。

以第一批次样本为例，配置浓度梯度为： 0.02，0.1，0.5，1 μg·mL-1的标准β-胡萝卜素溶液进行HPLC分析，

得到β-胡萝卜素浓度(x)与高效液相色谱特征峰峰面积(y)的线性表达式：y=64 909x-1 213.8，R2为0.997，具有相当高的线性关系。通过该表达式和HPLC积分而得到的特征峰峰面积，可以得到提取液中β-胡萝卜素的浓度。

1.4 化学计量方法

采用了多元线性回归(MLR)、偏最小二乘法回归(PLSR)和最小二乘支持向量机(LS-SVM)对样本的拉曼光谱数据进行分析，建立定量模型。采用校正集相关系数(Rc)、交叉验证均方根误差(RMSECV)、预测集相关系数(Rp)和预测均方根误差(RMSEP)作为比对分析与评价模型的评判标准。

多元回归是指多个影响因素作为自变量来解释因变量的变化，因此更适用于实际问题的研究。当多个自变量与因变量之间是线性关系时，所进行的回归分析就是多元线性回归(MLR)。

偏最小二乘法回归(PLSR)，可以同时实现回归建模、数据结构简化以及两组变量之间的相关性分析，从而在多个自变量中提取出系列包含最大预测效果的隐含变量(Latent Variables)，来解释因变量。

支持向量机(SVM)通过结构风险最小化原理来提高泛化能力, 能较好地解决小样本、非线性、高维数、局部极小点等实际问题, 已在模式识别、信号处理、函数逼近等领域得到了应用。最小二乘支持向量机(LS-SVM)是支持向量机的一种扩展。

MLR建模输入自变量为三个特征频移对应光强，而PLSR与LS-SVM建模的输入自变量均为拉曼光谱所检测到的有效频移波段对应光强，三种建模方法的输出值均为HPLC所测得的样本内β-胡萝卜素含量。拟在三种化学计量方法中取一种预测精度更高的方法来建立较为可靠的预测模型。

使用的数据处理软件包括Unscrambler 10.1(CAMO AS, Oslo, Norway)、Matlab R2013a(The Math Works, Natick, MA, USA)，Spectrasuite(Ocean Optics，USA)。

2 结果与讨论

2.1 高效液相色谱数据

通过HPLC测得各个枇杷果实提取液β-胡萝卜素浓度，乘以稀释倍数，可得枇杷果实中β-胡萝卜素含量，含量分布如图1所示。

2.2 β-胡萝卜素标准样品粉末的光谱曲线

图1 参考值频率分布图

图2 β-胡萝卜素标准样品粉末拉曼图谱

2.3 枇杷果实原始光谱曲线

本实验采集的是枇杷果实800.31～2 001.92 cm-1范围的350个拉曼光谱数据。选取90个样品的平均光谱，所获拉曼原始光谱曲线如图3所示。

图3 枇杷果实原始拉曼光谱图

对比图2和图3，可以发现相比于β-胡萝卜素标准样品粉末的拉曼图谱，枇杷果实原始拉曼光谱中的3个特征频移位置的峰并不明显，图谱曲线整体上漂，仅有1 521.64 cm-1处出现比较明显的峰，其他两个特征频移位置波峰并不明显。其原因是由于在实际采集样本拉曼光谱时，存在较为强烈的荧光背景，不利于进一步的数据分析，因此还需要对样本原始拉曼光谱曲线进行适当预处理，以便消除荧光背景的干扰。

2.4 荧光背景去除

利用拉曼光谱对样本(尤其是有机或生物样本)进行分析时的一个主要问题就是荧光背景干扰特别强烈，使得潜在的拉曼光谱信噪比非常低[5]。而降低荧光背景干扰的方法主要分为两类： 实验方法和化学计量法[9]。前者对样本依赖性大，且成本高昂，因此多选择化学计量法对拉曼光谱进行背景扣除。本文所采用多项式拟合(PF)。PF(polynomial fitting)，是一种非线性拟合工具，对于许多不规则的函数曲线有比较好的拟合效果[10，14]。当其被应用到拉曼光谱背景扣除中的时候，因为其拟合优劣由多项式阶数决定。因此需要分析人员人工剔除拉曼光谱中“非对象”谱线，并且选择合适的多项式阶数以确保拟合效果。利用PF对截取的可用部分(800.31～2 001.92 cm-1)拉曼光谱进行分析，多项式阶数为5。扣除荧光背景后的枇杷果实拉曼光谱如图4所示。

图4 枇杷果实多项式拟合拉曼光谱图

图4中可以发现经过处理的拉曼光谱出现3个较为明显的峰值，波数分别为1 521.64, 1 159.14和982.88 cm-1，表明采用PF去除枇杷果实拉曼光谱荧光背景的方法是可行的。比较图2和图4，发现在枇杷果实样本中观测到的特征信号与纯β-胡萝卜素拉曼峰的位置稍有差异，这种转变的原因可能是植物内在类胡萝卜素与植物基质相互作用[11]，改变了他们的化学形态或物理结构，从而影响了特征拉曼谱带的波数位置[7-8]。本实验中采用了3个成熟阶段的枇杷果实作为实验对象，图5显示了3个成熟阶段枇杷果实的拉曼图谱，可以发现成熟枇杷果实的拉曼散射峰值较高，推测是由于完全成熟的枇杷果的β-胡萝卜素含量较高。

2.5 建立模型

由于第一批枇杷果实处于未成熟阶段，其β-胡萝卜素含量极低，部分样本中β-胡萝卜素含量低于HPLC的检测限(约为0.05 μg·g-1)，因此无法得到这部分的参考值，所以在建模过程中将这部分样本剔除(共计23个)。目的是建模和预测集数据的选择更具有代表性，将剩余样本按浓度升序排列，以校正集与预测集比例2∶1，均匀提取数据，并保证浓度最小和浓度最大的两个样品包含于校正集中，从而构成校正集(共计45个)和预测集(共计22个)，见表1。所有建模光谱数据来源见1.2节。

图5 三个成熟阶段平均拉曼图谱(背景扣除后)

表1 校正集和预测集描述

2.5.1 MLR

图6 MLR预测值与参考值线性拟合图

2.5.2 PLSR

图7 PLSR预测值与参考值线性拟合图

2.5.3 LS-SVM

图8 LS-SVM预测值与参考值线性拟合图

2.6 MLR，PLSR，LS-SVM模型的比较

表2 β-胡萝卜素三种模型校正集与预测集结果

3 结 论

利用拉曼光谱对枇杷果实内β-胡萝卜素的含量进行预测。建模结果表明以可用光谱段建立的LS-SVM模型预测结果最为精确，其预测相关系数Rp达到0.91，可以成功实现较为精准的预测活体枇杷内β-胡萝卜素的含量的目的。相比其他光谱学方法，本文利用拉曼光谱对植物活体检测具有易于携带、操作简单、分析快速以及预测精度高等优点，也对未来研制果蔬类胡萝卜素快速、无损、现场检测设备提供了一定的参考，为拉曼光谱检测技术在农产品品质以及安全检测领域的发展奠定了理论基础。

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*Corresponding author

(Received Apr. 20, 2015; accepted Aug. 11, 2015)

Study on Non-Detective Determination of β-Carotene Content in Loquats with Raman Spectroscopy

WANG Tao, QIU Zheng-jun*, ZHANG Wei-zheng, ZHAO Yan-ru, HE Yong

College of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

In china，researches on Raman spectroscopy in terms of foodstuff mainly focus on carbohydrates, fatty acids, proteins and vitamins. Conventional methods for determining the carotenoids content require the extraction of the samples as well as other cleanup steps. In this work，Raman spectroscopy is applied to get the measured value form loquats with different mature stage which are compared with the reference value get from High Performance Liquid Chromatography (HPLC)，in order to find new，fast，and nondestructive calibration methods for quantification of β-carotene content in loquat fruits. Least Squares Support Vector Machine and Partial least squares data processing methods are used to analyze the Raman spectra while PLS model has a prediction quality with the correlation coefficient of 0.845; the root-mean-square error of 0.022 μg·g-1and LS-SVM model has a better prediction quality with the correlation coefficient of 0.910 with the root-mean-square error of 0.058 μg·g-1.

β- Carotenoids；Loquats；Raman spectroscopy；HPLC

2015-04-20，

2015-08-11

国家“十二五”科技支撑计划项目(2014BAD04B04)资助

王 涛，1992年生，浙江大学生物系统工程与食品科学学院博士研究生 e-mail: wtxjzx0330@163.com *通讯联系人 e-mail: zjqiu@zju.edu.cn

O657.3；S667.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)11-3572-06