冻融移植周期中单、双囊胚及卵裂期双胚胎移植结局的临床分析

梁明明 唐永梅 韦立红 李忻琳

广西壮族自治区柳州市妇幼保健院(545001)

·临床研究·

冻融移植周期中单、双囊胚及卵裂期双胚胎移植结局的临床分析

梁明明 唐永梅 韦立红 李忻琳*

广西壮族自治区柳州市妇幼保健院(545001)

目的：探讨冻融移植周期中单、双囊胚和卵裂期双胚胎移植的结局。 方法：2012年1月～2014年5月柳州市妇幼保健院生殖中心行冻融移植周期2735个，其中卵裂期胚胎移植1648个周期，囊胚移植1087个周期。回顾性分析≤35岁或>35岁患者移植单、双囊胚和双卵裂期胚胎的结局。结果：对于优质或次优囊胚移植，≤35岁或>35岁患者单囊胚移植的临床妊娠率、足月分娩率、活产率、早产率和流产率与优质双卵裂期胚胎移植比较，均无统计学差异(P>0.05)；单囊胚移植的临床妊娠率和多胎率显著低于双囊胚移植(P<0.05)。对于非优质囊胚移植，≤35岁或>35岁患者单囊胚移植与非优质双卵裂期胚胎移植比较，除流产率外，临床妊娠率、种植率、足月分娩率、多胎率、活产率和早产率均无统计学差异(P>0.05)；单囊胚移植的多胎率和活产率显著低于双囊胚移植(P<0.05)。结论：冻融移植周期中，在患者年龄和胚胎质量相同的条件下，单囊胚移植能够获得与双卵裂期胚胎移植相似的临床妊娠率、足月分娩率和活产率，降低双囊胚移植带来的多胎妊娠风险。

辅助生殖；冷冻；解冻；囊胚

长期以来双胚胎移植策略的实施，使得胚胎移植助孕的多胎妊娠发生率居高不下。因多胎妊娠属于高危妊娠范畴，其围产儿死亡率和畸形率与单胎妊娠相比显著增加[1]，如何降低多胎率成为近年来生殖医学工作者研究的课题。而单胚胎移植被认为是目前降低多胎妊娠率的最佳手段[2]。目前，执行单胚胎移植仍存在一些技术和认识上的问题：单胚胎移植成功率低；不孕患者对多胎妊娠风险的认识不足；生殖医学工作者片面追求单次妊娠成功率；当前缺乏选择性单囊胚移植技术标准[3]。 本文回顾性分析比较冻融移植周期中单、双囊胚和卵裂期双胚胎移植的结局 ，以期为临床优选移植方案提供参考。

1 资料和方法

1.1 研究对象

2012年1月～2014年5月在柳州市妇幼保健院生殖健康助孕中心行冻融移植周期2735个，其中双卵裂期胚胎移植1648个周期，囊胚移植 1087个周期。按患者年龄分为≤35岁和>35岁。

1.2 控制性超促排卵和胚胎培养方法

控制性超促排卵采用常规长方案或短方案。采用长方案者于上次月经黄体中期开始皮下注射长效曲普瑞林1.0～1.3mg/d，20d后给予促性腺激素(Gn)促排卵，在此过程中根据B超及血清雌二醇(E2)检测情况进行药物剂量调整，当直径≥18 mm的优势卵泡占直径≥14mm卵泡的50%以上时，肌内注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)5000～10 000U。采用短方案者在月经第2～3d开始皮下注射短效曲普瑞林0.1mg/d进行垂体降调节，连用2d，月经第4～5d开始注射Gn 150～450U/d，当阴道B超显示有2个以上直径≥18mm的优势卵泡，肌内注射hCG5000～10 000U。两方案均在注射hCG后34～36h后取卵，4～6h后进行常规体外受精(IVF)和卵胞浆内单精子注射(ICSI )。第3天上午根据胚胎形态进行卵裂期胚胎评级，胚胎评级主要参照Peter卵裂期评分标准[4]并做修改：I级胚胎为卵裂球大小均匀，无包浆碎片；II级胚胎为卵裂球大小均匀，胞浆碎片<20%；III级胚胎为卵裂球大小不均匀，胞浆碎片<50%；IV级胚胎为卵裂球大小均匀或不均匀，胞浆碎片>50%。评分为I级或II级的胚胎为优质胚胎，III级和IV级为非优质胚胎。对于行囊胚移植的患者，延长其胚胎培养时间至第5天或第6天。囊胚评级参照Gardner评级标准[5]：内细胞团(ICM)A级为ICM清晰，细胞多且排列紧密；B级为ICM细胞较少，松散；C级为ICM很少，有碎片或色泽黑。滋养层(TE)评级：A级为细胞多，细胞连接紧密；B级为细胞数较少，连接较松；C级为细胞很少。本研究中，ICM和TE评级为CC级的囊胚为非优质囊胚；均为B级以上的囊胚为优质囊胚；仅一项评为C级的囊胚为次优囊胚。

1.3 胚胎冷冻解冻和胚胎移植

胚胎玻璃化冻融采用Origio公司的冷冻液和解冻液试剂盒，并按试剂盒说明书中的方法进行操作。卵裂期胚胎或囊胚解冻后根据患者夫妇的意愿移植1～2枚胚胎或囊胚。患者子宫内膜准备采用人工周期或者自然周期，移植后14d测尿 hCG阳性者诊断为生化妊娠，第30天B超观察到孕囊者诊断为临床妊娠。

1.4 妊娠结局评价指标

临床妊娠率(临床妊娠周期数/移植周期数)、种植率(孕囊数/移植胚胎数)、多胎率(>1个孕囊的妊娠周期数/临床妊娠周期数)、足月分娩率(足月分娩周期数/临床妊娠周期数)、活产率 (分娩胎儿的周期数/移植周期数)、早产率(妊娠28～<37足周的周期数/临床妊娠周期数)、流产率(妊娠<28周的周期数/临床妊娠周期数)。

1.5 统计学分析

使用SPSS17.0统计软件进行统计分析，计数资料比较采用χ2检验和Fisher确切概率法，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 移植优或次优质单、双囊胚及优质双卵裂期胚胎的结局

≤35岁患者移植优或次优质单囊胚 的种植率明显高于移植优质双卵裂期胚胎(P<0.05)，且多胎率明显降低(P<0.05)。移植优或次优质单囊胚的临床妊娠率和多胎率显著低于移植优或次优质双囊胚(P<0.05)。见表1。>35岁患者移植优或次优质单囊胚的多胎率显著低于移植优质双卵裂期胚胎 (P<0.05)，移植优或次优质单囊胚的多胎率和临床妊娠率显著低于移植优质双卵裂期胚胎(P<0.05)。其中有1例单囊胚移植后出现单卵双胎妊娠。见表2。

2.2 移植非优质单、双胚囊及非优质双卵裂期胚胎的结局

≤35岁患者移植非优质单囊胚的流产率与移植非优质双卵裂期胚胎有统计学差异(P<0.05)。移植非优质单囊胚的临床妊娠率、多胎率和活产率 低于移植非优质双囊胚(P<0.05)。见表3。>35岁患者移植非优质单囊胚与移植非优质双卵裂期胚胎的临床妊娠率、种植率、多胎率、足月分娩率、活产率和早产率以及流产率均无统计学差异。移植非优质单囊胚的多胎率和活产率低于移植非优质双囊胚(P<0.05)。见表4。

2.3 不良妊娠结局

本资料有13例双胎妊娠为宫内宫外同时妊娠，其中8例发生流产，5例经手术和保胎治疗后，足月分娩4例、早产1例。双胎妊娠后新生儿畸形 9例，2例双胎均为先天性心脏病，3例其中一胎患先天性心脏病，1例双胎均有心脏发育畸形，1例其中一胎患小耳畸形，1例双胎均患有尿道下裂，1例其中1胎患有多趾畸形。单胎妊娠后出现新生儿异常3例，1例患先天性心脏病，1例患有多指趾畸形，1例患有心脏室缺、尿道下裂。

表1 ≤35岁患者移植优或次优质囊胚与优质双卵裂期胚胎结局的比较[%(周期)]

*与移植优或次优质双囊胚比较P<0.05#与移植优质双卵裂期胚胎比较P<0.05

表2 >35岁患者移植优或次优质囊胚与优质双卵裂期胚胎结局的比较[%(周期)]

*与移植优或次优质双囊胚比较P<0.05#与移植优质双卵裂期胚胎比较P<0.05

表3 ≤35岁患者移植非优质囊胚与非优质双卵裂期胚胎结局的比较[%(周期)]

*与移植非优质双囊胚比较P<0.05#与移植非优质双卵裂期胚胎比较P<0.05

表4 >35岁患者移植非优质囊胚或非优质双卵裂期胚胎结局的比较[%(周期)]

*与移植非优质双囊胚比较P<0.05#与移植非优质双卵裂期胚胎比较P<0.05

3 讨论

选择一个高种植潜能的胚胎进行移植被认为是降低多胎率的一项有效策略[6]。 本研究中，无论卵裂期胚胎还是囊胚，移植2个的多胎率均较高(10.7%～ 48.9% )，尤其是移植优或次优质双囊胚的多胎率高达47%以上。因为多胎率增高导致围产儿死亡和胎儿畸形的风险增加，因此临床工作中应该严格控制胚胎移植数量，尽量避免多胎妊娠。

Berin等[7]对比冻融囊胚胎移植结局的结果显示，移植双囊胚的临床妊娠率和活产率显著高于单囊胚移植，但移植双囊胚的多胎率也显著增高。Guerif等[8]研究结果中，移植单囊胚的多胎率显著低于双卵裂期胚胎移植，同时两者的妊娠率和分娩率没有统计学差异。张波等[9]研究显示，选择性单囊胚移植与卵裂期胚胎移植相比，临床妊娠率没有统计学差异(47.35 % ，47.29%，P=0.988)，但多胎率显著降低(0.86% ， 24.59%，P<0.001 )。值得注意的是，其研究中对评为BB级以上的予单囊胚移植，评为BC级及其以下的囊胚予双囊胚移植。因为次优囊胚在临床工作中通常简化描述为III级囊胚(ICM或TE评级中有一项评为C级的囊胚，包含AC，CA，BC和CB)，通常会给予双囊胚移植。而本研究将次优囊胚与优质囊胚合并统计，结果显示，移植优质囊胚或次优囊胚组，无论≤35岁还是>35岁患者，单囊胚移植的临床妊娠率虽然显著低于双囊胚移植，但与优质双卵裂期胚胎移植的临床妊娠率没有统计学差异，可见单囊胚移植也可以达到很好的临床妊娠率；而且单囊胚移植的多胎率显著低于双囊胚移植和双卵裂期胚胎移植。因此，对于优质囊胚或次优质囊胚，无论≤35岁还是>35岁患者，选择单囊胚移植能够获得与移植优质双卵裂期胚胎相似的临床妊娠率，同时能够显著降低多胎妊娠率。

活产率是评价移植策略优劣的重要指标，近年来辅助生殖技术的活产率通常达到20%～30%[10]。在本研究中，患者年龄或胚胎质量相同条件下，单囊胚移植的活产率虽然显著低于双囊胚移植，但与双卵裂期移植没有显著差异，仍是较好的妊娠结局。因此从活产率上比较，单囊胚移植策略适用于不同患者年龄和胚胎质量的人群。

种植率方面，虽然在≤35岁患者中，移植单个优质或次优囊胚的种植率显著高于移植优质双卵裂期胚胎。但是在>35岁患者中未见差异。Campbell等[11]研究显示，在女方年龄<40岁组中，囊胚非整倍体比例达到51.9%，当女方年龄≥40岁时，囊胚非整倍体比例升高至86.1%。所以随年龄增长，非整倍体囊胚的几率增加，可能是导致>35岁患者囊胚种植率下降的原因。

胚胎移植后流产的原因与患者年龄、胚胎质量、胚胎操作以胚胎与内膜之间发育是否同步等因素有关。林明媚等采用logistic回归分析结果中显示[12]，无论移植新鲜胚胎还是冻融胚胎，囊胚移植的流产率均低于第3日卵裂期胚胎，而且年龄是影响早期流产的主要因素。而wang等[13]的结论相反，其结果显示冻融囊胚移植的流产风险较冻融卵裂期胚胎的高14%。本研究中，当患者年龄>35且移植优或次优质胚胎时，双卵裂期胚胎移植的流产率显著高于双囊胚移植；当年龄>35移植非优质胚胎时，双卵裂期胚胎移植、单囊胚移植和双囊胚移植三者之间的流产率没有统计学差异。在≤35岁患者中，无论胚胎质量，双囊胚移植的流产率显著高于双卵裂期胚胎移植。这一结果表明，不同胚龄的胚胎移植后的流产率在不同患者年龄以及胚胎质量条件下会有不同的结果，对于≤35岁患者，移植优质或非优质双囊胚均可能增加流产风险；而年龄>35的高龄患者移植优质双囊胚的流产率降低。因本研究样本量较小，不同胚龄、患者年龄以及胚胎质量与流产率之间的关系需要进一步扩大样本量，以获得更可靠的结论。

因为非优质胚胎的临床妊娠率较低，临床上通常给予双胚胎或双囊胚移植，以达到可接受的临床妊娠率。本资料显示，≤35岁患者移植双囊胚的临床妊娠率和活产率虽然显著高于移植单囊胚，同时多胎率也显著增高。而对>35岁患者，移植双囊胚的临床妊娠率与移植单囊胚比较没有统计学差异，但多胎率显著增高。因此，在移植非优质囊胚时，不可低估多胎妊娠风险，并在移植前需要充分告知患者由其权衡利弊后选择移植策略。

张波等[3]建议关注累计妊娠率和累计多胎率的理念，其研究显示，1次新鲜单囊胚移植+1次冻融单囊胚移植的累计妊娠率与1次新鲜双囊胚移植+1次冻融双囊胚移植相比无差异，且前者的多胎率显著降低。当前囊胚培养技术和囊胚玻璃化冷冻技术已经取得良好效果并被普遍应用，利用实时成像系统这一新技术有助于人们选择高种植潜能的胚胎[14-15]，为进一步推广单囊胚移植，实现安全、高效的辅助生殖技术的目标，创造更为有利的条件。

[1] 董耘，高颖.多胎减胎术的应用进展[J].现代妇产科进展，2013，22(5)：422-424.

[2] Thurin A, Hausken J, Hillensj T, et al. Elective single embryo transfer versus double embryo transfer in in vitro fertilization[J]. N Engl J Med, 2004, 351(23): 2392-2402.

[3] 张波，冯贵雪，周虹，等.选择性单囊胚移植与双卵裂胚移植的临床结局比较[J].生殖医学杂志，2013，22(1)：30-33.

[4] PR Brinsden. A textbook of in vitro fertilization and assisted reproduction[M]. NewYork: The part heno Publishing Group Inc, 1999:196.

[5] Gardner DK, Lane M, Stevens J, et al. Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome: towards a single blastocyst transfer[J].Fertil Steril, 2000, 73(6): 1155-1158.

[6] Kang SM , Lee SW, Yoon SH, et al. Comparison of clinical outcomes between single and double vitrified-warmed blastocyst embryo transfer according to the day of vitrification[J]. Fertil Steril, J Assist Reprod Genet, 2013, 30(6):779-785.

[7] Berin I, McLellan ST, Macklin EA, et al. Frozen-thawed embryo transfer cycles: clinical outcomes of single and double blastocyst transfers[J]. J Assist Reprod Genet, 2011, 28(7): 575-581.

[8] Guerif F, Frapsauce C, Chavez C, et al. Treating women under 36 years old without top-quality embryos on day 2: a prospective study comparing double embryo transfer with single blastocyst transfer[J]. Hum Reprod, 2011, 26:775-781.

[9] 张波，冯贵雪，周虹，等.选择性单囊胚移植在降低多胎率中的应用[J].国际生殖健康/计划生育杂志，2012，32(1)：38-41.

[10] 孙莹濮. 重视辅助生殖技术相关的遗传学检测及筛查[J].生殖与避孕，2014，34(9)：699-700.

[11] Campbell A, Fishel S, Laegdsmand M. Aneuploidy is a key causal factor of delays in blastulation: author response to 'A cautionary note against aneuploidy risk assessment using time-lapse imaging' [J]. Reproductive BioMedicine Online, 2013, 28(3): 279-283.

[12] 林明媚，罗璐，李涛，等.囊胚和卵裂期胚胎的早期胚胎流产率比较[J].生殖与避孕，2013，33(5)：311-315.

[13] YA Wang，D Healy，D Black, et al. Age-specific success rate for women undertaking their first assisted reproduction technology treatment using their own oocytes in Australia, 2002-2005[J]. Human Reproduction, 2008,23(7):1633-1638.

[14] Meseguer M, Herrero J, Tejera A, et al. The use of morphokinetics as a predictor of embryo implantation[J]. Human Reproduction, 2011,26(10):2658-2671.

[15] Desai N, Ploskonka S, Goodman LR, et al. Analysis of embryo morphokinetics, multinucleation and cleavage anomalies using continuous time-lapse monitoring in blastocyst transfer cycles[J]. Reprod Biol Endocrinol, 2014,12(1): 1-10.

[责任编辑：张 璐]

Clinical analysis on pregnant outcomes of single or double blastocyst transfer, and double cleavage embryo transfer in frozen-thawed cycles

LIANG Mingming, TANG Yongmei, WEI Lihong, LI Xinling*

LiuzhouMaternityandChildHealthCareHospital,Guangxi, 545001

*Correspondingauthor:LIXinling,Email:lxling0868@163.com

Objective: To explore pregnant outcomes of single blastocyst transfer (SBT), double blastocyst transfer (DBT) and double cleavage embryo transfers(DCET) in frozen-thawed cycles. Method: A retrospective study was conducted to analyze pregnant outcomes of women experienced embryo transfer in frozen-thawed cycles from January 2012 to May 2014 in Assisted Reproduction of Liuzhou Maternity and Child Health Care Hospital. A total of 2735 cycle including frozen-thawed cleavage embryo transfer (n=1648) and frozen-thawed blastocyst transfers (n=1087) were analyzed. Retrospectively analyzed was had used to compare the pregnant outcomes of SBT or DBT and CET among patients with 35 or less years old and over 35 years old. Result: For high quality or sub quality blastcyst transfer, the rate of clinical pregnancy, term births, live birth, preterm birth or abortion had no significant difference between women with SBT and women with DCET (P>0.05). The rate of clinical pregnancy of women with DBT had significant higher than that of women with SBT or DCET (P<0.05). The multiple pregnancy rate of women with SBT was significant lower than that of women with DBT or DCET (P<0.05).For non high quality blastocyst transfer, excepted to the rate of spontaneous abortion, rate of clinical pregnancy, rate of multiple pregnancies and rate of live birth had no significant difference between women with SBT and women with DCET (P>0.05). Rate of multiple pregnancy or live birth in women with SBT was significant lower than that of women with DBT(P<0.05). Conclusion: As for embryo transplantation in frozen-thawed cycle, when the age and embryo quality of women are the same, women with SBT and women with DCET have the similar rate of clinical pregnancy, rate of implantation, rate of term labor and rate of livebirth .And women with SBT had lower rate of multiple pregnancy than that of women with DBT.

Assisted Reproductive Technology; Frozen-thawed; Blastocyst

广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研课题(Z20130614)

2016-02-01

2016-08-13

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.10

*通讯作者：lxling0868@163.com