乙醇-硫酸铵双水相提取马齿苋总黄酮工艺研究

郝红英，牛美兰，王 研，樊亚蕾，孙莉红

(黄河科技学院医学院，河南郑州 450063)

乙醇-硫酸铵双水相提取马齿苋总黄酮工艺研究

郝红英，牛美兰，王 研，樊亚蕾，孙莉红

(黄河科技学院医学院，河南郑州 450063)

摘要[目的]优化乙醇-硫酸铵双水相提取马齿苋总黄酮工艺。[方法]采用乙醇-硫酸铵双水相体系提取马齿苋中主要成分黄酮，以总黄酮得率为指标，采用单因素和正交试验，考察提取溶剂浓度、料液比、提取时间、提取温度对总黄酮提取工艺的影响，确定乙醇-硫酸铵双水相体系提取马齿苋总黄酮的工艺。[结果]试验最佳提取条件为脱脂马齿苋粉末2.0 g，乙醇用量27.50%(W)、硫酸铵16.00%(W)、料液比1∶20、温度60 ℃、时间40 min，在此条件下，马齿苋总黄酮提取率为7.23%。[结论]乙醇-硫酸铵双水相提取法提取效率高、操作简便，提取剂价格便宜，是一种很有发展前途的提取方法。

关键词乙醇-硫酸铵双水相；马齿苋；总黄酮；提取工艺；正交设计

马齿苋又名马齿草、长寿菜、五行草等，为马齿苋科一年生肉质草本植物[1]，具有清热解毒、散血消肿、抗菌的功效，主治肠炎、菌痢、痈肿、恶疮、丹毒、蛇虫咬伤、痔疮肿毒、湿疹、急性和亚急性皮炎等多种疾病[2]。马齿苋中的主要成分为黄酮类物质，其具有抗氧化、降糖、抗病毒、抗菌、消炎、抗溃疡的药理作用[3-4]。马齿苋黄酮的提取工艺包括有机溶剂提取法[5]、超声波法[6]、微波法[7]、酶解法[8]、树脂法[9]等。近几年，双水相萃取技术因设备投资少、操作简单，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域，且双水相萃取体系具有价廉、低毒、较易挥发等特点[10]。笔者采用乙醇-硫酸铵双水相体系提取马齿苋中主要成分黄酮，以总黄酮得率为指标，采用单因素和正交试验，考察提取溶剂浓度、料液比、提取时间、提取温度对总黄酮提取工艺的影响，确定乙醇-硫酸铵双水相体系提取马齿苋总黄酮的工艺，为马齿苋的合理利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料芦丁标准样品(中国药品生物制定检定所，生化试剂)，其他试剂均为分析纯。马齿苋(药店所受中草药)。电热恒温水浴箱(北京市永光明医疗仪器厂)，SHZ-D(III)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)，7230G可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)。

1.2方法

1.2.1标准曲线的绘制。马齿苋中黄酮类化合物含量的测定参照文献[11-12]的方法，以芦丁为标样测定马齿苋黄酮类化合物的含量，所得标准曲线回归方程为Y=0.093 8X+0.000 1(R2=0.999 8)，式中，Y为芦丁质量浓度(g/mL)；X为吸光度。

1.2.2马齿苋总黄酮的提取。称取马齿苋干细粉(过60目筛)于索氏提取器中，经石油醚脱脂，并除去部分色素。称取处理样品2.0 g于 250 mL碘量瓶中，按一定的料液比加入乙醇-硫酸铵双水相溶液，置于恒温水浴箱，提取一段时间后，过滤，静置分层，将滤液用分液漏斗将两相分开，将醇相提取液高速离心 25 min，即得马齿苋黄酮类化合物提取液，后经微孔滤膜过滤，精密称取一定量用甲醇定容至250 mL，以供分析测试用。

1.2.3马齿苋总黄酮的测定。取2.5 mL样品溶液至25 mL容量瓶中，加5%(W)的NaNO21 mL，摇匀，放置5 min后加入10%(W)的Al(NO3)31 mL，5 min后再加入4%(W)的NaOH 10 mL，摇匀，用蒸馏水稀释至刻度，10 min后于7230G 型分光光度计上在510 nm处测定吸光度A，根据芦丁标准曲线回归方程，得到提取液浓度，总黄酮提取率按照公式Et=(C×V×D)/W×100%计算，式中，Et为提取率，C为测得的提取液浓度，V为提取液体积，D为稀释倍数，W为原料的质量。

1.2.4单因素试验。

1.2.4.1乙醇浓度对马齿苋总黄酮提取率的影响。水浴温度为40 ℃，固定硫酸铵用量6.4 g[16.00%(W)]、料液比1∶20[m(马齿苋)∶m(双水相溶剂)]、提取时间30 min的条件下，称取处理样品2.0 g，选择不同浓度乙醇[25.00%、27.50%、30.00%、32.50%、35.00%(W)]，分别考察其对马齿苋总黄酮提取率的影响。

1.2.4.2料液比对马齿苋总黄酮提取率的影响。水浴温度为40 ℃，在恒定的乙醇浓度32.50%、硫酸铵用量16.00%、提取时间30 min的条件下，称取处理样品2.0 g，选择不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)，分别考察其对马齿苋总黄酮提取率的影响。

1.2.4.3提取温度对马齿苋总黄酮提取率的影响。在恒定的乙醇浓度32.50%、硫酸铵用量16.00%、料液比1∶25、提取时间30 min的条件下，称取处理样品2.0 g，选择不同超声波处理温度(30、40、50、60、70 ℃)，分别考察其对马齿苋总黄酮提取率的影响。

1.2.4.4提取时间对马齿苋总黄酮提取率的影响。水浴温度为40 ℃，在恒定的乙醇浓度32.50%(W)、硫酸铵用量16.00%(W)、料液比1∶25的条件下，称取处理样品2.0 g，选择不同提取时间(20、30、40、50、60 min)，分别考察其对马齿苋总黄酮提取率的影响。

1.2.5正交试验。 称取处理样品2.0 g，以乙醇质量浓度、提取温度、料液比、提取时间为考察因素设计 L9(34)正交表，并按照此正交表安排试验。

2结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1乙醇浓度对马齿苋总黄酮提取率的影响。由图1可知，在硫酸铵用量一定的情况下，随着乙醇用量的增加，总黄酮提取率逐渐增加，当无水乙醇的用量为32.50%时达最大；此后，随着无水乙醇用量的增加，总黄酮提取率显著下降。其主要原因可能是：乙醇浓度过低不利于黄酮的浸出，随着乙醇浓度的增加，双水相体系的分相能力增加，乙醇在上层的体积也逐渐增加，总黄酮的溶解度增加，一些脂溶性有机物的溶出量也会增加，抑制了总黄酮的浸出，综合考虑这些因素，确定最佳的无水乙醇含量为32.50%。

图1　乙醇浓度对马齿苋总黄酮提取率的影响Fig.1　Effects of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.1.2料液比对马齿苋总黄酮提取率的影响。由图2可知，在硫酸铵和无水乙醇用量比例一定的情况下，随着料液比的增加，总黄酮的提取率逐渐增加，当料液比为1∶25时达最大；此后，随着料液比的增加，总黄酮提取率开始降低。原因可能是：料液比较小时，溶剂渗透并扩散到细胞内的速度以及黄酮化合物向溶剂中扩散的速度小，如果料液比较大时，虽然有利于溶剂进入细胞内破坏疏水键，利于黄酮化合物向溶剂中扩散，但会耗费大量的溶剂和硫酸铵，综合考虑，料液比选1∶25较好。

图2　料液比对马齿苋总黄酮提取率的影响 Fig.2　Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.1.3提取温度对马齿苋总黄酮提取率的影响。从图3可看出，当提取温度为40 ℃时，马齿苋中总黄酮提取率达最大；此后，温度继续升高，马齿苋中总黄酮提取率开始下降。其主要原因是：虽然温度增加能使分子运动加快，能增加黄酮类化合物的浸出，但也增加了乙醇的挥发，导致总黄酮提取率下降。另外温度过高时，一定量的总黄酮可能会被氧化破坏。综合考虑这些因素，选取最佳提取温度为40 ℃。

图3　提取温度对马齿苋总黄酮提取率的影响Fig.3　Effects of temperature on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.1.4提取时间对马齿苋总黄酮提取率的影响。由图4可见，马齿苋中总黄酮提取率在20～50 min时随着提取时间的延长而升高，在50 min时达最大，继续延长提取时间总黄酮提取率反而下降。原因可能是：在提取初期，马齿苋中的总黄酮不断浸出，随着提取时间的延长，总黄酮的浸出率逐渐达到最大。如果继续延长，乙醇挥发量增加，会引起总黄酮提取率降低。考虑到提取率以及节约能耗等方面的因素，选取最佳提取时间为50 min。

图4　提取时间对马齿苋总黄酮提取率的影响Fig.4　Effect of time on extraction rate of total flavonoids from purslane

2.2正交试验在单因素考察的基础上，为了得到更好的条件，采用 L9(34)正交表来安排正交试验。由表1可知，各因素对马齿苋总黄酮提取率影响由大到小依次为提取温度、料液比、乙醇含量、提取时间，其中提取温度对马齿苋中总黄酮提取率的影响最大。由分析结果初步认为，乙醇-硫酸铵双水相体系提取马齿苋总黄酮的最佳条件为：在马齿苋为2.0 g的情况下，硫酸铵为16.00%，无水乙醇用量27.50%、料液比1∶20、温度60 ℃、时间40 min。

表1　正交试验设计与结果

2.3平行试验为进一步验证正交试验结果的可考性和重现性，按照所得最佳条件做了3次平行试验。结果表明，使用该方法优化出了乙醇-硫酸铵双水相提取马齿苋总黄酮最佳工艺条件，在该条件下提取率为7.23%，不但提取率高，且试验的重现性好。

3讨论

(1)乙醇-硫酸铵双水相提取法是一种新型的液-液萃取技术，反应条件温和，萃取时间短，提取效率高，操作简便，乙醇、硫酸铵价格便宜，几乎不存在有机残留问题，是一种很有发展前途的提取方法。

(2)通过单因素试验、正交试验法，优选出马齿苋总黄酮的双水相最佳提取工艺：脱脂马齿苋粉末2.0 g，无水乙醇含量27.50%、硫酸铵16.00%、料液比1∶20、温度60 ℃、时间40 min，在此条件下，马齿苋总黄酮提取率为7.23%。

参考文献

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[4] 张华芳.羊栖菜提取物的降血糖作用研究[J].时珍国医国药，2006，17(2)：3-4.

[5] 章爱华，邓斌，陈小原.马齿苋中黄酮类化合物的提取工艺研究[J].农产品加工·学刊，2008(5)：18-19.

[6] 张特立，于春月.马齿苋中总黄酮的提取工艺研究[J].黑龙江医药科学，2013，36(4)：37-38.

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[8] 翟硕莉，付艳梅.马齿苋黄酮提取方法研究进展[J].衡水学院学报，2012，14(4)：39-41.

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[12] 赵晨晨，承伟，王立冬.微波辅助提取络石藤总黄酮的工艺研究[J].中草药，2012，43(4)：718- 720.

Extraction of Total Flavonoids from Purslane Using Ethanol-Ammonium Sulfate Aqueous Two Phase System

HAO Hong-ying, NIU Mei-lan, WANG Yan et al

(Medical School, Huanghe Science and Technology College, Zhengzhou, Henan 450063)

Abstract[Objective] The aim was to optimize the extraction technology of total flavonoids from purslane using ethanol / ammonium sulfate aqueous two phase system. [Method] The flavonoids from purslane was extracted by using ethanol / ammonium sulfate aqueous two phase system. With total flavonoids yield as indicator, adopting single factor and orthogonal test, effects of solvent concentration, sloid-liquid ratio, time, temperature on extraction process were investigated. [Result] The optimal extraction conditions were: 2.0 g non-fat purslane powder, ethanol 27.50%(W), ammonium sulfate 16.00%(W), solid-liquid ratio 1∶20, temperature 60 ℃, and time was 40 min. Under the above conditions, the extraction rate of total flavonoids was 7.23%. [Conclusion] The extraction efficiency of ethanol-ammonium sulfate aqueous two phase system is high, the operation is simple, and the extracting solvent is cheap, so it is a promising extraction method.

Key wordsEthanol-ammonium aqueous two phase system; Purslane; Total flavonoids; Extraction technology; Orthogonal design

基金项目郑州市科技局科研项目(20140787)；黄河科技学院大学生实践创新项目(2015XSCXCY008)。

作者简介郝红英(1979- )，女，河南商丘人，副教授，硕士，从事制药工程与天然产物提取研究。

收稿日期2016-03-15

中图分类号S 567.21+9；R 284.2

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)11-145-03