中华根瘤菌NP1亚硝酸盐还原酶基因的表达和酶学性质研究

袁会兰，边晨凯，陈度宇，张 宇，许 雷

(中国农业科学院研究生院，北京 100081)

中华根瘤菌NP1亚硝酸盐还原酶基因的表达和酶学性质研究

袁会兰，边晨凯，陈度宇，张 宇，许 雷1*

(中国农业科学院研究生院，北京 100081)

摘要[目的]研究中华根瘤菌NP1(Sinorhizobium sp.NP1)中亚硝酸盐还原酶基因(nir)的原核表达情况以及粗酶液的化学性质。[方法]构建该基因的原核表达载体pET32a-nir，然后对重组蛋白质进行SDS-PAGE和Western blotting分析获得NIR酶在原核生物中的表达情况。通过测定粗酶液对亚硝酸盐降解情况研究相关酶学性质。[结果]SDS-PAGE检测结果表明，可溶性融合表达产物约为57 ku，其中亚硝酸盐还原酶大小约40 ku，与酶分子量的预估值一致；Western blotting证实该蛋白可与根据亚硝酸盐还原酶合成的多克隆抗体发生强阳性反应；酶学性质分析表明，亚硝酸盐还原酶活力约为247.15 U/mL，最适pH 6.5，最适反应温度37 ℃，该酶对NaCl的耐受性为0.3 mol/L。[结论]亚硝酸盐还原酶蛋白重组质粒能在大肠杆菌系统中高效表达，研究其酶学性质为生物清除提供了技术保障。

关键词中华根瘤菌；亚硝酸盐还原酶；原核表达；生物清除

亚硝酸盐是自然界氮循环中的重要物质，广泛存在于土壤、水和植物中，同时也是目前养殖水体中鱼类死亡的主要因子，严重威胁着水体中很多珍稀鱼类和动物的生命安全。研究发现，亚硝酸盐主要通过与鱼体血红素结合成高铁血红素，使鱼体内氧气减少从而影响鱼类的生理活动致其死亡[1-4]。随着人们生活水平的提高，饮食习惯也发生了很大变化，很多食物中亚硝酸盐成为诱发心血管疾病的因素之一[5]；亚硝酸盐还是强致癌物亚硝胺的前体物质，与食品中蛋白质分解中间产物仲胺反应形成亚硝胺，可诱发多种癌症如肝癌和咽癌[6]等。此外，含氮化合物还是大气中细颗粒物(PM2.5)成分之一，而PM2.5的大小对人类的身心健康有很大影响[7-8]。因此，实现亚硝酸盐的生物清除具有重要的现实意义。

Sinorhizobiumsp.NP1为中国农业科学院生物学教研室分离的一株高效脱氮的异养硝化菌[9]。笔者利用已获得的亚硝酸盐还原酶基因(nir)[10]构建该基因的原核表达载体，经诱导表达，获得具活性的粗酶液，并测定该酶的一些特性，以期为生物脱氮的工业应用提供参考。

1材料与方法

1.1材料及主要试剂试验菌株苜蓿中华根瘤菌NP1(Sinorhizobiumsp.NP1)为中国农业科学院生物学教研室分离。亚硝酸盐还原酶基因(nir)(GenBank登录号为FJ598613)。各限制性内切酶、T4连接酶和Gene Walking试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司。基因组和质粒提取试剂盒以及胶回收试剂盒购自Omega公司。PCR引物及基因测序均由北京擎科生物技术有限公司完成。

1.2方法

1.2.1亚硝酸盐定量测定方法。利用N-(1-萘基)-乙二胺光度法[11]对溶液中亚硝酸盐进行定量测定，亚硝酸盐最低检出量为0.003 mg/L，最高检出量为0.200 mg/L。若亚硝酸盐浓度大于0.200 mg/L，需对样品进行稀释。

1.2.2亚硝酸盐还原酶原核表达载体的构建和表达。

1.2.2.1亚硝酸盐还原酶原核表达载体的构建。根据目的基因的序列，结合pET32a表达载体上的内切酶切位点，设计nir带酶切位点引物进行PCR扩增。

F-CGCGGATCCATGACTGAACAACTTC(BamHI)

R-CCCAAGCTTCTACATCGACGC(HindIII)

将纯化后的PCR产物与PET32a分别用BamHI和HindIII双酶切，酶切片段胶回收，T4 DNA连接酶连接，构建nir原核表达载体。转化后筛选插入nir基因的重组pET32a载体，提取重组载体，转化BL21，筛选重组pET32a表达载体质粒。

1.2.2.2SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物。挑阳性克隆pET32a-nir在LB液体培养基中37 ℃、220 r/min过夜培养，1%接菌量转接入LB液体培养基中培养至菌液A600为0.6～0.8，1 mmol/L IPTG诱导nir的表达，诱导条件：30 ℃、180 r/min诱导2～3 h，然后用等体积PBS溶液洗2次，加2 mL PBS溶液进行超声破碎(超声3 s，停5 s，共10 min)，与4×Loading buffer混合后高温煮10 min，再13 000 r/min离心10 min，取20 μL样品进行SDS-PAGE电泳(5%浓缩胶电压80 V，1 h，12%分离胶电压120 V，时间2～3 h)，将其中一块凝胶用考马斯亮蓝R250染色，另一块凝胶进行100 mA过夜转膜，转膜结束后用丽春红染色1～2 min，经水冲洗后用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭4 h，以500倍稀释的中华根瘤菌NP1菌株亚硝酸盐还原酶抗原免疫兔血清为一抗，500倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔血清为二抗进行免疫印迹分析。

1.2.3亚硝酸盐还原酶粗酶性质测定。

1.2.3.1亚硝酸盐还原酶粗酶活力。挑取阳性克隆pET32a-nir和含空载体pET32a对照组菌在LB液体培养基中37 ℃、220 r/min过夜培养，1%接菌量转接入LB液体培养基中37 ℃、220 r/min培养至菌液A600为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，30 ℃、180 r/min诱导6 h。超声破碎离心取上清获得粗酶液。

1.2.3.2粗酶活力最适pH。用不同pH缓冲液和亚硝酸钠标准溶液配制底物溶液，分别调节pH为3.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、9.0、10.0和11.0，加入等量粗酶液，37 ℃下反应2 h，测定粗酶活力。

1.2.3.3粗酶活力最适温度。在最适pH条件下，分别于20、30、35、37、40、45、50和60 ℃水浴中测定粗酶活力。

1.2.3.4NaCl对粗酶活力的影响。在最适pH和温度条件下，分别设置NaCl浓度为0、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mol/L，测定粗酶活力。

2结果与分析

2.1亚硝酸盐还原酶原核表达载体的构建和表达

2.1.1亚硝酸盐还原酶重组表达载体的构建。 将已测序确认含有目的片段的TA克隆质粒，经BamHI和HindIII酶切位点消化后切胶回收目的产物并在T4 DNA连接酶作用下与经BamHI和HindIII酶消化的pET32a载体连接，转化至表达菌株BL21，双酶切(图1)验证成功获得nir基因的重组表达载体pET32a-nir。提取表达菌株中质粒DNA测序后证实，载体插入片段与目的基因序列完全一致，未发现碱基突变。

注： M.DL5 000分子质量标准，1.pET32a-nir酶切，2.pET32a酶切，3.PCR产物的酶切。Note： M.DL5 000 Marker；1.Digestion of recombinant plasmid pET32a-nir；2.Digestion of plasmid pET32a；3.Digestion of PCR product.图1　表达载体双酶切鉴定结果Fig.1　Electrophoresis of DNA samples digested with BamHI and HindⅢ

2.1.2SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定表达产物。1 mmol/L IPTG诱导后的宿主菌液经超声匀浆后取上清进行SDS-PAGE，结果见图2。由图2可知，诱导重组表达菌与诱导空载体菌相比目的蛋白大量表达，而未诱导的2种菌株蛋白质表达量未见明显差异。Western blotting免疫印迹显示，中华根瘤菌NP1 亚硝酸盐还原酶抗原免疫兔血清能与诱导重组表达菌的57 ku蛋白带发生强阳性反应，而空载体菌在相应位置未检测到免疫反应条带。样品中免疫反应杂带较多可能是由于合成的多克隆抗体(图3)。

注： M.蛋白marker，1.pET32a-nir诱导，2.pET32a诱导，3.pET32a-nir未诱导，4.pET32a未诱导。Note：M.Protein marker，1.Induced expression of pET32a-nir，2.Induced expression of pET32a，3.No induced expression of pET32a-nir，4.No induced expression of pET32a.图2　诱导表达产物的SDS-PAGE分析Fig.2　SDS-PAGE analysis of the products induced expression

注： M.蛋白marker；1.pET32a-nir诱导，2.pET32a诱导，3.pET32a-nir未诱导，4.pET32a未诱导。Note：M.Protein marker，1.Induced expression of pET32a-nir，2.Induced expression of pET32a，3.No Induced expression of pET32a-nir，4.No Induced expression of pET32a.图3　诱导表达产物的Western blotting分析Fig.3　Western blotting analysis of the products induced expression

2.2亚硝酸盐还原酶酶学性质

2.2.1亚硝酸盐还原酶粗酶活力。测得该酶粗酶液活力为247.15 U/mL，可用于后续试验。

2.2.2最适pH。由图4可知，在pH为5～8时，酶活力较高，反应的最适pH为6.5；对照组空载体未检测到明显酶活性。

图4　pH对亚硝酸盐还原酶活力的影响Fig.4　Effects of pH on the activity of NIR

2.2.3最适温度。由图5可知，在温度为30～45 ℃时酶活力均较强，酶活力最适温度为37 ℃。当温度低于20 ℃时，酶活力较低；当温度高于55 ℃时，酶活力基本丧失。对照组空载体未检测到明显酶活性。

图5　温度对亚硝酸盐还原酶活力的影响Fig.5　Effects of temperature on the activity of NIR

2.2.4NaCl对粗酶活力的影响。由图6可知，当NaCl浓度低于0.3 mol/L时，对酶活力影响较小；当NaCl浓度再增加时该酶活性受到抑制，逐渐降低直至无活性。水产养殖的水体中存在一定的盐浓度，淡水盐浓度一般不超过0.05%，海水平均盐浓度为3.5%。因此，利用该粗酶液可以在淡水养殖中通过快速去除水体中亚硝酸盐发挥重要作用。

图6　NaCl对亚硝酸盐还原酶活力的影响Fig.6　Effects of NaCl on the activity of NIR

3结论与讨论

参考文献

[1] WANG Z W，ZHANG Y D，LI X Y，et al.Hazards of ammonia，nitrogen and nitrite in pond and control measures[J].Jilin water resources，2013(3)：39-40.

[2] ADELMAN I R，KUSILEK L I，KOEHLE J，et al.Acute and chronic toxicity of ammonia，nitrite，and nitrate to the endangered topeka shiner(Notropistopeka)and fathead minnows(Pimephalespromelas)[J].Environmental toxicology & chemistry，2009，28(10)：2216-2223.

[3] SHINN C，MARCO A，SERRANO L.Influence of low levels of water salinity on toxicity of nitrite to anuran larvae[J].Chemosphere，2013，92(9)：1154-1160.

[4] 叶俊.亚硝酸盐急性胁迫对草鱼血液生理生化指标和非特异性免疫性能的影响[D].武汉：华中农业大学，2013.

[5] HORD N G.Dietary nitrates，nitrites，and cardiovascular disease[J].Current atherosclerosis reports，2011，13(6)：484-492.

[6] SONG P，WU L，GUAN W X.Dietary nitrates，nitrites，and nitrosamines intake and the risk of gastric cancer：A meta-analysis[J].Nutrients，2015，7(12)：9872-9895.

[7] TILLETT T.Hearts over time：Cardiovascular mortality risk linked to long-term PM2.5exposure[J].Environmental health perspectives，2012，120(5)：205.

[8] HOEK G，KRISHNAN R M，BEELEN R，et al.Long-term air pollution exposure and cardio-respiratory mortality：A review[J].Environmental health，2013，12(1)：43.

[9] 宋琴.一株新型氨氮降解菌株的分离鉴定及相关功能基因的克隆[D].北京：中国农业科学院，2008.

[10] 刘钰莹.脱氮关键酶基因的克隆、鉴定及高效脱氮菌株的构建[D].北京：中国农业科学院，2010.

[11] 马翠娥，张月香.N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定亚硝酸盐氮实验用水的研究[J].山西化工，1997(3)：44-45.

[12] 江云.水产养殖废水生物净化技术研究[D].扬州：扬州大学，2013.

[13] MEI X，GAO T.Removal of nitrite-nitrogen in source water by biological process[J].Environmentalence & technology，2000，91(3)：3-7.

[14] PENG Y Z，ZHU G.Biological nitrogen removal with nitrification and denitrification via nitrite pathway[J].Applied microbiology & biotechnology，2006，73(1)：15-26.

[15] FRISON N，FABIO S D，CAVINATO C，et al.Best available carbon sources to enhance the via-nitrite biological nutrients removal from supernatants of anaerobic co-digestion[J].Chemical engineering journal，2013，215/216(2)：15-22.

Expression of Nitrite Reductase Gene ofSinorhizobiumsp. NP1 and the Enzymatic Properties

YUAN Hui-lan, BIAN Chen-kai, CHEN Du-yu, XU Lei*et al

(Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

Abstract[Objective] To study the prokaryotic expression and enzymatic properties of nitrite reductase gene of Sinorhizobium sp. NP1. [Method] Prokaryotic expression vector pET32a-nir was constructed. Then, Western blotting and SDS-PAGE analysis were performed to study its expression in prokaryote. The enzyme properties were studied by measuring the degradation of nitrite. [Result] The result of SDS-PAGE showed that the fusion expression product was about 57 ku, including 40 ku target protein, which was consistent with the molecular weight of the enzyme. Western blotting confirmed that the protein had a strong positive reaction with the polyclonal antibody which was synthesized by NIR. Enzymatic properties analysis showed that the activity of the enzyme was 247.15 U/mL, the optimum reaction pH value was 6.5, the optimum reaction temperature was 37 ℃, the tolerance to NaCl was 0.3 mol/L. [Conclusion] The recombinant plasmid of NIR could be efficiently expressed in E. coli, and the study of enzymatic properties provides a technical support for the biological removal of .

Key wordsSinorhizobium sp.; Nitrite reductase; Prokaryotic expression; Biological removal of

基金项目国家高技术研究发展计划资助项目(2006AA10C413)。

作者简介袁会兰(1987-)，女，山东菏泽人，硕士研究生，研究方向：微生物分子生物学与基因工程。*通讯作者，研究员，从事环境微生物与分子生物学研究。

收稿日期2016-03-28

中图分类号Q 812

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)11-132-03