盐穗木金属硫蛋白HcMT在大肠杆菌中高效表达及金属离子结合能力的检测

孟红恩 杜荣俸 徐鑫 刘忠渊

（新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046）

盐穗木金属硫蛋白HcMT在大肠杆菌中高效表达及金属离子结合能力的检测

孟红恩 杜荣俸 徐鑫 刘忠渊

（新疆大学生命科学与技术学院 新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐 830046）

旨在研究盐穗木金属硫蛋白HcMT基因原核表达情况及结合金属离子的能力。从盐穗木中克隆获得的金属硫蛋白（HcMT）基因亚克隆至pGEX-6p-2原核表达载体上，在大肠杆菌BL21中表达，分离纯化融白蛋白GST-HcMT，通过原子吸收分光光度法测定融合蛋白GST-HcMT结合金属离子的量以判断其与金属离子的结合能力。结果显示，诱导表达的融合蛋白GST-HcMT分子量在34 kD左右，与预期一致，且通过Western blot进一步得到验证；原子吸收结果表明其具有结合Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+的能力，融合蛋白结合Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+的量分别是对照的25倍、10倍、4倍和2倍，其结合能力大小为Cu2+>Cd2+>Zn2+>Pb2+。

盐穗木金属硫蛋白；原子吸收分光光度法；金属离子结合能力

金属 硫蛋白（Metallothioneins，MTs）是一类相对分子质量较低（约6-7 kD）、富含半胱氨酸残基、能与金属离子结合的胞质蛋白，在几乎所有真核生物以及一些原核生物中都有表达［1-2］。从NCBI中可以检索到1 013个植物MTs序列和类MTs序列，它们在所有主要类群的维管植物中都存在，包括种子植物、裸子植物、蕨类植物和拟蕨类植物［3］。尽管它们的进化起源还未完全清楚［4］，但它们的序列具有相同的特征。植物MTs根据半胱氨酸残基位置和排列顺序的不同可以分为3类，即I类、II类和III类（Class I，II，III）。I类MTs含有两个小的富含半胱氨酸残基的结构域，中间被一个不含有半胱氨酸残基的间隔序列（大约30-40个氨基酸）隔开，其中的Cys按C-X-C、C-X-X-C和C-C（X为除半胱氨酸的其他氨基酸）的方式排列，根据蛋白序列中半胱氨酸残基位置与排列顺序的不同又可以分为4个亚型（Type 1-4）［5］。大部分植物MTs都是I类MT。Type 2型植物金属硫蛋白通常含有14个半胱氨酸残基，主要在叶中表达［6］。

金属硫蛋白在清除自由基、金属离子的代谢与解毒等生命进程中发挥着重要作用［2，7］。一些植物金属硫蛋白的表达可以被过氧化物、盐、干旱、冷、重金属等非生物胁迫所诱导表达［1，8-10］。螯合金属离子是金属硫蛋白中巯基簇的主要功能［6］，金属硫蛋白可以结合Zn2+、Cd2+、Hg2+、Cu2+、Pb2+等离子，并可参与维持金属离子的稳态［11］。有研究发现每种金属硫蛋白对某一种离子有较高的亲和性而对其他离子只有较低的亲和性［12］。在大肠杆菌、酵母以及其他植物中过表达Type 2型金属硫蛋白可以增强其对金属离子的耐受性以及富集更多相应的金属离子。例如，在大肠杆菌中表达海茄苳（Avicennia marina）金属硫蛋白AmMT2可以增强其对Zn2+、Cu2+、Pb2+和 Cd2+的耐受性，且对Cd2+有较高的亲和力［13］。木榄（Bruguiera gymnorrhiza）金属硫蛋白BgMT2 同样可以结合Zn2+、Cu2+、Pb2+和 Cd2+［14］。过表达芥菜（Brassica juncea）金属硫蛋白BjMT2的大肠杆菌中显示出较强的拮抗Cu2+和 Cd2+胁迫的能力，而转BjMT2的拟南芥若不外源添加Cu2+其根的生长将受到抑制［15］。同样，过表达天蓝遏蓝菜（Thlaspi caerulescens）金属硫蛋白TcMT2a和TcMT3的拟南芥根的生长受到影响［16］，这可能与金属硫蛋白参与必需金属元素的代谢相关。而转盐穗木（Arabidopsk thaliana）金属硫蛋白AtMT2b烟草可以提高其对亚砷酸盐的敏感性以及根至芽中的迁移［17］。这些结果表明金属硫蛋白可能是以结合金属离子的形式参与植物体内金属离子的稳态以及运输。而且，不同植物中不同的金属硫蛋白对各种金属离子有不同的亲和力［18，19］。每一种金属硫蛋白都能与多种金属离子结合，而每一亚型的金属硫蛋白的作用机理还不明确，因此研究每一个植物金属硫蛋白的功能对于更好地理解它们在植物中的作用有重要的意义。

本研究从盐穗木（Halostachys caspica）中分离鉴定一个Type 2型金属硫蛋白基因（HcMT）并亚克隆至pGEX-6p-2表达载体，原核表达并纯化融合蛋白GST-HcMT，以期检测其与金属离子的结合能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株 原核表达载体pGEX-6p-2为新疆生物资源基因工程重点实验室保存，pMD18-T 载体购自TaKaRa公司，菌株DH5α和BL21（DE3）购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂 各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）以及DNA标准品购于TaKaRa公司。Taq DNA聚合酶、胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自天根生化科技有限公司。GST Bind Resin和填料柱购自Novagen公司。PVDF膜购自Millipore公司，显色试剂购自碧云天生物技术公司。引物合成及序列测定由上海生工生物工程股份有限公司完成。其他常用试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 原核表达载体的构建 根据盐穗木金属硫蛋白（HcMT）cDNA基因（GenBank登录号：HS586-469.1）序列设计了2条引物：上游引物Pl：5'-CCGG AATTCCCATGTCTTGCTGTGGTGG-3'，下游引物P2：5'-CCGCTCGAGTCATTTGCAGGTGCAAGGG-3'，并分别在上、下游引物中插入EcoR I和Xho I酶切位点（下划线部分）。通过PCR扩增、胶回收后连接到pMD18-T载体上构成重组质粒pMD18-T-HcMT。质粒pMD18-T-HcMT与pGEX-6p-2分别用EcoR I和Xho I双酶切，将双酶切后的pGEX-6p-2和HcMT片段经T4 DNA连接酶4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，抗生素筛选，挑取阳性克隆进行菌液PCR鉴定、测序鉴定。

1.2.2 SDS-PAGE检测HcMT的表达 将测序正确的pGEX-6p-2-HcMT质粒转化BL21（DE3）感受态细胞。阳性单克隆接种于5 mL含50 mg/L Amp的LB培养基，37℃、220 r/min过夜培养，按体积比1∶100转接入50 mL LB（含Amp）新鲜培养基，相同条件下继续培养，当OD600达到0.4-0.6时，加IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导表达4 h，收集2 mL菌液离心，沉淀用100 μL 1×SDS上样缓冲液彻底悬浮，煮沸15 min，15% SDS-PAGE电泳分析表达结果。

1.2.3 融合蛋白的纯化及浓度测定 12 000 r/min，10 min离心收集大量诱导表达后的菌体，用4%（体积分数）的冰冷1×GST洗涤缓冲液（4.3 mmol/L Na2HPO4，1.47 mmol/L KH2PO4，0.137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，pH7.3）重悬，超声破碎，离心收集上清液。取GST Bind Resin填料装柱，使其自然沉降，用5倍柱床体积的冰冷1×GST洗涤缓冲液平衡，将收集的上清液逐滴加到柱子上，控制流速每小时10倍柱床体积左右，然后用10倍柱床体积的1×GST洗涤缓冲液洗涤柱子，5倍柱体积的GST洗脱缓冲 液（50 mmol/L Tris-HCI，10 mmol/L Glutathione，pH8.0）洗脱目的蛋白，分别收集各阶段的流出液。15% SDS-PAGE电泳分析，Brandford法测定洗脱蛋白溶液的浓度。同时纯化原核表达的谷胱甘肽转移酶（GST）标签蛋白作为对照。

1.2.4 Western blot鉴定 将纯化的GST-HcMT融合蛋白、GST标签蛋白以及诱导表达后的重组菌裂解上清液和转空载体的BL21裂解上清液进行SDSPAGE电泳，转膜（转移槽0.65 mA/cm稳流2 h），用5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，加入用TBST（Tris缓冲盐-吐温溶液，含10 mmol/L pH7.6 Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20）1∶5 000稀释的鼠ANTI-GST一抗，室温轻摇2 h，TBST洗膜3次，每次5 min；加入用TBST 1∶10 000稀释的羊抗鼠IgG，室温轻摇2 h，TBST洗膜3次，每次5 min； BeyoECL显色液显色，观察PVDF膜上的显色条带。

1.2.5 GST-HcMT与金属离子的结合能力检测［13，14］为了研究HcMT结合金属离子的能力，分别将含有pGEX-6p-2和pGEX-6p-2-HcMT质粒的大肠杆菌E. coli（BL21）过夜培养物以1∶100转接入50 mL LB（含Amp）新鲜培养基。当OD600达到0.4-0.6时，加入终浓度0.4 mmol/L 的IPTG，与此同时向其中添加终浓度分别为200 μmol/L Al3+、200 μmol/L Cu2+、200 μmol/L Mg2+、200 μmol/L Zn2+、100 μmol/L Cd2+、100 μmol/L Mn2+、20 μmol/L Pb2+和2 μmol/L Hg2+金属离子混合物，37℃过夜诱导。按1.2.4所述方法分离纯化得到GST-HcMT，以GST标签蛋白作为对照。将蛋白样品硝化溶解于15%稀硝酸中，采用原子分光光度法（Atomic Absorption Spectrometry，AAS）测定各金属离子含量。为了测定其结合Pb2+、Zn2+、Cd2+的能力，在加入IPTG的同时单独分别向培养基中加入终浓度为300 μmol/L Pb2+、400 μmol/L Zn2+或200 μmol/L Cd2+，离心洗涤菌体后，按如上方法分离纯化蛋白，然后测定各金属离子含量。每个样品重复3次，数据用Graph Pad Prism 5进行分析。

图1 HcMT与其他Type 2型金属硫蛋白的序列比对

2 结果

2.1 HcMT序列分析

将HcMT序列与其他一些Type 2型金属硫蛋白序列比对（图1）显示，它们都具有相似的典型的结构特征。通过MEGA 4.0系统进化树分析（图2）显示，其与海蓬子（Salicornia brachiata）进化起源更近。

2.2 GST-HcMT表达与条件优化

将鉴定正确的pGEX-6p-2-HcMT、pGEX-6p-2转入菌液并分别诱导表达，结果（图3）显示，前者诱导后能够表达出大小33 kD左右的蛋白条带，而后者只在26 kD处有一蛋白条带，与预期大小一致。

图2 HcMT与其他Type 2型金属硫蛋白的系统进化树分析

图3 SDS-PAGE检测GST-HcMT表达情况

图4 SDS-PAGE鉴定纯化的GST-HcMT

图5 Western blot鉴定纯化后的GST-HcMT

2.3 GST-HcMT纯化及Western blot鉴定

用GST亲和层析柱纯化后的蛋白洗脱液，经SDS-PAGE（图4）分析后发现皆可得到纯度相对较高的目的蛋白。然后将纯化后的蛋白进行Western blot鉴定，结果（图5）表明在34 kD位置出现了一条明显的条带，与SDS-PAGE中GST-HcMT融合蛋白的位置相符。

2.4 GST-HcMT与金属离子的结合能力检测

在诱导过程中，向培养基中外源添加各种金属离子之后分离纯化融合蛋白，运用AAS测得各离子的量如表1所示。与对照组GST相比，融合蛋白GST-HcMT能够结合更多的Cd2+、Cu2+、Zn2+，对Mg2+、Mn2+、Al3+和Hg2+没有显著性差异，而对Pb2+的结合量显著性比对照小。Pb2+的结合量显著性下降引起了我们的兴趣，因此选择在混合添加过程中差异极显著的代表Cd2+、差异显著的代表Zn2+以及Pb2+进行分别单独在诱导过程中向培养基中添加实验。采用相同的方法测结合金属离子的含量，结果（表2）显示，每摩尔GST对照能够结合Cd2+、Zn2+、Pb2+这3种离子的摩尔数分别为0.549、0.958和2.171，而每摩尔融合蛋白GST-HcMT能够结合Cd2+、Zn2+和Pb2+这3种离子的摩尔数分别为5.438、4.068、 4.604，基本上分别是对照的10倍、4倍和2倍。

表1 AAS测得的GST和GST-HcMT的摩尔比（金属离子/蛋白）

表2 单一金属离子实验下AAS测得的GST和GST-HcMT的摩尔比（金属离子/蛋白）

3 讨论

植物金属硫蛋白是一类在大多数的器官中表达的低分子量多肽，通常认为其主要的作用是重金属的解毒与维持必需金属离子的稳态。而作为金属离子螯合剂，它们同样在不同的生理进程中发挥作用，包括清除ROS、响应各种逆境胁迫、调节植物的生长等［15，20，21］。但植物金属硫蛋白的功能机制，尤其是在金属与自由基胁迫下的生物学功能，仍有待于进一步的阐明。

由于金属硫蛋白中丰富的半胱氨酸极不稳定且常不以单体的形式存在，很难检测其在体内的表达活性［22］。用于纯化的GST标签蛋白为研究小分子蛋白质提供了解决方法，同时由于GST标签蛋白可以抑制MTs特别是其铰链区在大肠杆菌中被蛋白水解酶降解［6，23］，因而本研究选用含GST标签的融合蛋白来研究HcMT结合金属离子的能力。结果显示与GST相比，GST-HcMT融合蛋白具有较强的结 合金属离子的能力，如Zn2+、Cu2+和Cd2+，提示一些金属离子优先与GST-HcMT融合蛋白中的HcMT结合。铜离子与锌离子是两种必需的参与氧化还原的金属离子，当过量时有潜在的毒性。植物需要从环境中获得Zn2+和Cu2+，所以它们需要调节这两种金属离子在细胞与组织间的上调、存储、分布与排出。锌与铜的缺失或过量都会影响植物的生长［24，25］。锌与铜是必须金属元素中与金属硫蛋白结合量最大的两种，而且它们与植物金属硫蛋 白的结合也被广泛研究［10］。HcMT既能与Zn2+也能与Cu2+结合，而且与Zn2+的结合量更高，但GST-HcMT与GST的摩尔比之比显示HcMT对Cu2+的选择性结合可能更好一些。一些研究表明尽管植物金属硫蛋白对金属离子的亲和力不同，但其表达以及与金属离子的结合能力在维持植物体金属耐受性和金属离子稳态发挥着重要作用。其他重金属离子更多的是对植物体造成氧化胁迫，如Cd2+等［14］，而植物金属硫蛋白是其ROS清除系统中重要的一部分，本实验显示出的金属硫蛋白与重金属离子的结合能力使重金属在体内累积以解除其毒害，可以看出这也是植物应对重金属胁迫的一种方式。而在表1中融合蛋白GSTHcMT相比于对照GST结合量较少的Pb2+通过单独添加测得数据的表2中可以看出，融合蛋白GSTHcMT还是可以选择性结合Pb2+的，产生表1相反的结果一方面可能是由于混合添加时Pb2+加入量较少，另一方面可能是由于混合添加时其他金属离子的干扰造成的。AAS法在进行多元素测定时确实存在准确度与精密度较差的缺陷［26，27］。而在单独添加Cd2+、Zn2+时，融合蛋白GST-HcMT和对照蛋白GST与混合添加相比结合金属离子的含量都显著性提高，但融合蛋白GST-HcMT与对照蛋白GST相比每摩尔结合的金属离子的量都极显著的提高，这一结果与混合添加时相一致。综合表1与表2结果可以看出，HcMT结合金属离子的能力Cu2+>Cd2+>Zn2+>Pb2+。这些结果与其他一些2型金属硫蛋白［28-31］的结果相似，植物金属硫蛋白可以与多种金属离子结合，无论是一价离子［32］、二价离子还是更高价离子，而且其亲和力也存在一定区别，推测可能与其生长环境等有一定的关系。

4 结论

本研究成功表达融合蛋白GST-HcMT，并得到Western blot验证，又通过原子吸收分光光度法得出其可以结合Cu2+、Cd2+、Zn2+和Pb2+，且表现出不同的结合能力，这与以前报道这一类金属硫蛋白的结果相吻合。

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（责任编辑 马鑫）

High-level Expression of a Type 2 Metallothionein Protein（HcMT）from Halostachys caspica in Escherichia coli and Its Metal-binding Ability

MENG Hong-en DU Rong-feng XU Xin LIU Zhong-yuan
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

This study aims to evaluate the prokaryotic expression and metal-binding ability of metallothionein protein in Halostachys caspica（HcMT）. HcMT cloned from H. caspica was transferred to prokaryotic expression vector pGEX-6p-2 and expressed in Escherichia coli BL21. Then the glutathione S-transferase（GST）fusion protein（GST-HcMT）was isolated and purified. Using atomic absorption spectrometry，the metal-binding ability of the GST-HcMT was determined by measuring the amount of metal ions it bound with. The results showed that the molecular weight of expressed fusion protein GST-HcMT was about 34 kD，which was as expected and confirmed by Western blot. Furthermore，GST-HcMT bound 25，10，4，2 folds of Cu2+，Zn2+，Pb2+，and Cd2+separately as GST alone，and the binding ability of GST-HcMT was as follows：Cu2+> Cd2+> Zn2+> Pb2+.

metallothionein protein from Halostachys caspica（HcMT）；atomic absorption spectrometry（AAS）；metal-binding ability

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.016

2015-07-28

新疆维吾尔自治区高技术研究发展项目（201416102）

孟红恩，男，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学；E-mail：menghongenxju@163.com

刘忠渊，男，博士，研究方向：生物化学与分子生物学；E-mail：lzy1168@163.com