食品中克罗诺杆菌的分离和鉴定

黄启红，蔡大川，张志军，方军，陈敏儿，黄璇莹，伍玲燕，熊娟，简艳婷（中国广州分析测试中心广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东广州510070）



食品中克罗诺杆菌的分离和鉴定

黄启红，蔡大川，张志军，方军，陈敏儿，黄璇莹，伍玲燕，熊娟，简艳婷
（中国广州分析测试中心广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东广州510070）

摘要：利用国标方法对食品（蔬菜，熟食和豆制品）进行了克罗诺杆菌的污染情况调查及其分离菌株的鉴定；利用fusA基因对分离的克罗诺杆菌进行了遗传多样性分析，将克罗诺杆菌属的分离株鉴定到种的水平。主要取得了以下结论和认识：①39份食品（蔬菜23份，熟食14份和豆制品2份）中有14份样品检出了克罗诺杆菌，检出率为35.9%。蔬菜类检出8份（34.8%），熟食制品检出4份（28.6%），2份豆制品都检出（100.0%）；②对14株克罗诺杆菌分离株进行基于fusA基因的系统进行分析，结果显示这些分离株包括C. Sakazakii和C. malonaticus 2个种，其中C. sakazakii有9株，C. malonaticus有5株。

关键词：食品；克罗诺杆菌；分离；种的鉴定

食品安全问题是关系到国民健康的重大民生问题。克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）是近年来倍受关注的重要食源性致病菌，能引起新生婴幼儿脑膜炎、菌血症和小肠结肠炎等严重疾病，致死率高达30%～80%。流行病调查表明克罗诺杆菌感染与婴幼儿配方奶粉密切相关，但目前克罗诺杆菌在自然界的污染源仍然不清楚。鉴于这种情况，本论文通过研究在广州肉菜市场采集不同类型的食品（蔬菜、熟食和豆制品）利用国标方法进行克罗诺杆菌随机抽样检测。克罗诺杆菌属的7个种的毒性之间有差异，并不是所有的种都与感染相关，只有阪崎克罗诺杆菌、丙二酸盐克罗诺杆菌和苏黎世克罗诺杆菌与新生儿感染相关［1］。因此，将这个新属的细菌鉴定到种的水平具有重要意义。本论文用最近国际上新建立的基于fusA的序列分析技术将分离菌株鉴定到种的水平，可以了解食品中该属种的分布情况，从而确定其毒性，掌握该菌的污染规律，可为控制该菌爆发提供基础数据，对提升食品安全水平具有重要意义。

1　材料与方法

1.1检测样本

39份样品分别来源于2013年6月～8月从广州越秀区的集贸市场采集蔬菜类、熟食制品类和豆制品。具体样品包括蔬菜类23份（2份小白菜，2份通菜，大黄瓜、大葱、椰菜、香菜、油麦菜、葱、辣椒圈、韭菜、芥菜、包菜、番薯叶、小塘菜、生菜、潺菜、大青菜、大头菜、番茄、茄子、竹笋各1份）；熟食制品14份（某品牌鸭腿、某品牌烤鸡腿、某品牌黑鸭鸭翅、某品牌鸭脖、香辣鸡扒、某品牌鸡腿、某品牌原味肠、某品牌鸡翅、鸡肉粉、炒青菜、熟鱼、热牛腩、红烧豆腐、豆角炒叉烧）和豆制品2份（豆皮和嫩豆腐）。

1.2设备

SHP-250型生化培养箱：上海一恒科技有限公司；DXY-33A电泳仪：北京六一仪器厂；ImageQuant 350 system UVP凝胶成像仪：美国GE Healthcare公司；TProfessional thermocycler PCR仪：德国Biometra公司。1.3试剂及培养基

改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素：广东环凯微生物科技有限公司；阪崎显色培养基：法国科玛嘉公司；阪崎肠杆菌生化试剂鉴定盒：广东环凯微生物科技有限公司；GoldViewTM Nucleic Acid Stain：北京赛百盛基因技术有限公司；细菌基因组DNA快速提取试剂盒、2×PCR DSMix：广州东盛生物工程有限公司。

1.4方法

主要根据GB 4789.40-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验》第一法进行检验，分离后进行fusA扩增引物和测序引物合成，进一步进行克罗诺杆菌基因组DNA的提取、PCR扩增、产物测序、最后进行序列分析比对，构建系统进化树，将分离菌株鉴定到种。

2　结果

2.1不同样品类型检测结果

本研究共采集39份样品（蔬菜类23份，熟食制品14份和豆制品2份），其中有14份样品检出了克罗诺杆菌，检出率为35.9%。蔬菜类检出8份（34.8%），熟食制品检出4份（28.6%），2份豆制品都检出（100.0%）结果见图1。共分离到14株克罗诺杆菌（H1-H14）。

2.2克罗诺杆菌分离株的种水平鉴定中PCR基因扩增结果

图1　不同样品类型检测结果Fig.1 Samples of different types of test results

提取到的14株克罗诺杆菌分离株DNA进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳，结果可以看出所有分离株都扩增出目标基因预期片段大小1 300 bp左右结果见图2，可以进行测序。

图2　14株克罗诺杆菌分离株的fusA基因扩增结果Fig.2 The fusA gene amplification results that 14 grams of Cronobacter spp. isolates

2.3构建进化树

将本实验中分离出来的14株克罗诺杆菌的fusA基因和相关菌株的fusA基因序列进行比对，这些fusA基因序列可以从GenBank软件上下载得到，再用ClustalX软件进行比对，从而构建系统发育树，见图3。从进化树可以比对出，这些分离株包括C. Sakazakii和C. malonaticus 2个种，其中C. sakazakii有9株，C. malonaticus有5株。

3　讨论

本文调查了39份样品，克罗诺杆菌在这些食品的污染率较高，高达35.9%，连熟食中的污染率都高达28.6%。克罗诺杆菌在煮熟的情况下会被杀灭，这些熟食在蒸煮或油炸过程中克罗诺杆菌已被杀灭，而实际检测结果却证明这些熟食含有克罗诺杆菌。熟食制品的克罗诺杆菌污染应该来源于做熟后的操作，也叫二次污染，比如在熟食蒸煮或油炸后放置熟食的器皿，后期加工时用的砧板、刀具、擦拭工具的抹布或是操作人员的手等都可能造成污染。

分离株的种水平鉴定结果显示食品中克罗诺杆菌分离株的优势菌种为阪崎克罗诺杆菌，这与国际上其他的有关克罗诺杆菌本身的鉴定结果和分型的研究一致［2-3］。出现此类情况一方面原因可能是由于环境中阪崎克罗诺杆菌的分布范围广，从而容易成为奶粉或其他食品的污染源。

图3　基于fusA基因构建的克罗诺杆菌系统发育树Fig.3 The Cronobacter spp. phylogenetic trees based on fusA gene

参考文献：

［1］Kucerova E，Clifton S W，Xia X Q，et al. Genome sequence of Cronobacter sakazakii BAA-894 and comparative genomic hybridization analysis with other Cronobacter species［J］. PLoS One，2010（5）：9556

［2］Iversen C，Lehner A，Mullane N，et al. The taxonomy of Enterobacter sakazakii：proposal of a new genus Cronobacter gen. nov. and descriptions of Cronobacter sakazakii comb. nov. Cronobacter sakazakii subsp. sakazakii，comb. nov.，Cronobacter sakazakii subsp. malonaticus subsp. nov.，Cronobacter turicensis sp. nov.，Cronobacter muytjensii sp. nov.，Cronobacter dublinensis sp. nov. and Cronobacter genomospecies 1［J］. BMC Evol Biol，2007（7）：64

［3］Xu X，Wu Q，Zhang J，et al. Occurrence and Characterization of Cronobacter spp. in Powdered Formula from Chinese Retail Markets ［J］. Foodborne Pathog Dis，2014（5）：1180-1185

Isolation and Identification of Cronobacter spp. in Foods

HUANG Qi-hong，CAI Da-chuan，ZHANG Zhi-jun，FANG Jun，CHEN Min-er，HUANG Xuan-ying，WU Ling-yan，XIONG Juan，JIAN Yan-ting
（Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for Dangerous Chemicals，China National Analytical Center，Guangzhou，Guangzhou 510070，Guangdong，China）

Abstract：The method of national standard was used to detect the occurrence of Cronobacter spp. From food （milk，vegetables，cooked and soy）and further identified the isolation strain. FusA gene was used to analyze the genetic diversity of separated Cronobacter spp.，which can identify species. This paper mainly has made the following conclusions and cognition：①There are 39 other foods（23 vegetables，14 cooked food and 2 of soy product）test too，14 of which detected Cronobacter spp.，in a rate of 35.9%. Vegetables were detected in 8 （34.8%），food products were detected in 4（28.6%），2 copies of soy products are detected（100.0%）.②Based on fusA gene，the genetic diversity was analyzed for 14 Cronobacter spp.，the result indicated that there are 9 C. sakazakii，and 5 C. malonaticus among these isolates.

Key words：foods；Cronobacter spp.；detection；characterization

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.046

基金项目：动物源性食品安全检测技术研究和公共服务平台（粤科规财字［2014］208号）；广东省专业镇中小微企业服务平台建设项目（2013B091604003）

作者简介：黄启红（1979—），女（汉），助理研究员，硕士，主要从事微生物检验与分析研究。

收稿日期：2015-03-05