外阴阴道念珠菌病的药敏及其基因的研究

张慧萍 严晨蕴 卢彩玲

外阴阴道念珠菌病的药敏及其基因的研究

张慧萍 严晨蕴 卢彩玲

目的:研究念珠菌对抗真菌药物的敏感性及其基因表达。方法: 对VVC患者的白带标本，培养分离真菌，利用API Candida 试剂鉴定菌种，采用琼脂弥散法对检出的菌株进行体外药敏试验，以PCR扩增法检测CDR1、CDR2的基因表达。结果:分离出120株念珠菌，白念珠菌83株（占69.2%）；光滑念珠菌23株（占19.2%）；白念珠菌对氟康唑、咪康唑、克霉唑、伊曲康唑和制霉菌素的耐药率分别为1.2%（1/83）、8.4%(7/83)、1.2%(1/83)、4.8%（4/83）和0.0%(0/83)；光滑念珠菌23株，对氟康唑和伊曲康唑的耐药率分别为26.1%(6/23)和8.7%(2/23)。念珠菌CDR1、CDR2阳性表达率分别62.5%（75/120）和60.8%（73/120）。结论:白念珠菌是VVC的主要念珠菌。体外药敏试验显示念珠菌对制霉菌素均不耐药。耐药基因CDR1、CDR2在多种念珠菌中均有表达。

外阴阴道念珠菌病；耐药性；基因；药敏

外阴阴道念珠菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）是由念珠菌引起的女性最常见的一种生殖道感染，70%～90%由白念珠菌引起，非白念珠菌以光滑念珠菌最常见。不同念珠菌对不同药物的敏感性不同,耐药现象成为念珠感染治疗的主要问题,现就外阴阴道念珠菌的药敏及其基因分布进行研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料

2015年7月至2015年12月在我院门诊诊治的120例VVC患者，年龄为20-48岁，平均年龄30.3±6.3岁，患者均有典型的典型症状包括外阴瘙痒、灼热、红肿、性交痛、分泌物异常。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集、培养、鉴定、药敏

采用灭菌棉拭子，取阴道侧壁及阴道后穹窿分泌物。对采集的标本接种于沙保罗培养基，采用法国生物梅里埃公司生产的API Candida 试剂盒进行鉴定，采用丹麦Rosco公司生产的酵母菌药敏片琼脂弥散法进行体外药敏试验。

判读标准参考Rosco提供的药敏试验标准，标准质控菌株为白色念珠菌ATCC6454 。见表1。

表1 抗真菌药敏试验判读标准

1.2.2 念珠菌的DNA提取及PCR扩增

共收集120株假丝酵母菌，取菌落接种于沙保罗肉汤培养液中以37℃培养24h后取将培养液置于离心试管中，离心机离心处理后取沉淀物，加入Solution A 500ul 充分混匀，37℃温浴1h后加入Solution B 100ul充分混匀，70℃温浴10min后加入Solution C 200ul充分混匀，冷却5min、离心5min，取上清液置于新的EP试管中，加入异丙醇充分混匀后离心5min，取沉淀物加入冷却的70%的乙醇液体500ul洗涤，离心5min取沉淀物干燥后加入TE Buffer溶解基因组DNA。CDR1、CDR2的基因序列引物及扩增参考相关文献[1]进行。扩增产物以1.2琼脂糖凝胶电泳，在专用的成像系统中观察结果。

2 结果

2.1 念珠菌的菌种分布

120 例患者中共分离出120株念珠菌，白念珠菌83株（占69.2%）；非白念珠菌37株（占30.8%），其中光滑念珠菌23株（占19.2%）；近平滑念珠菌和无名念珠菌各3株（各占2.5%）；克柔念珠菌、热带念珠菌和酿酒念珠菌各2株（各占1.7%）。

2.2 念珠菌的药敏试验结果

表2 光滑念珠菌对抗真菌药物敏感性

白念珠菌对氟康唑、咪康唑、克霉唑、伊曲康唑和制霉菌素的耐药率分别为1.2%（1/83）、8.4%(7/83)、1.2%(1/83)、4.8%（4/83）和0.0%(0/83)；非白念珠菌对氟康唑、咪康唑、克霉唑、伊曲康唑和制霉菌素的耐药率分别为16.2%(6/37)、5.4%(2/37)、0.0%(0/37)、5.4%(2/37)和0%(0/37)。

光滑念珠菌23株，对氟康唑、咪康唑、克霉唑、伊曲康唑和制霉素的敏感率分别为34.8%（8/23）、78.3%(18/23)、56.5%(13/23)、78.3%(18/23)和95.7%(22/23)。对氟康唑和伊曲康唑的耐药率为26.1%(6/23)和8.7%(2/23)，对咪康唑、克霉唑和制霉素不存在耐药菌株。

2.3 念珠菌耐药基因检测结果

念珠菌CDR1、CDR2阳性表达率分别62.5%（75/120）和60.8%（73/120）。

3 讨论

随着抗真菌药物的广泛应用，念珠菌对抗真菌药物耐药性增加，念珠菌菌谱有了一定的变化，非白色念珠菌造成的VVC的比例在逐渐上升。Richter等对429例培养阳性的VVC患者进行研究，共分离出593株念珠菌，其中白念珠菌420株，光滑念珠菌112株，近平滑念珠菌30株，克柔念珠菌12株，酿酒念珠菌9株，热带念珠菌8株，葡萄牙念珠菌和丝孢酵母各1株。本研究分离的120株念珠菌，白念珠菌83株（占69.2%）；非白念珠菌37株（占30.8%）。既往类似研究表明白念珠菌比例为20.1%～90%，光滑念珠菌则为18%～37%。

由于抗真菌药物、免疫抑制剂等广泛应用，念珠菌的感染逐渐增多，真菌对抗真菌药物的耐药性也日趋严重，抗真菌药敏试验有助于了解念珠菌株的耐药性，为临床治疗外阴阴道念珠菌病提供用药指导，对提高疗效具有一定的参考意义。Richter等从429例VVC患者阴道分泌物中分离出593株念珠菌进行体外药敏试验，对氟康唑的耐药率为3.7%，对伊曲康唑的耐药率为16.2%，对益康唑、克霉唑、咪康唑、酮康唑的耐药率为1.5%～5.7%。其中74.1%的光滑念珠菌、58.3%的克柔念珠菌、55.6%的酿酒念珠菌和3.4%的近平滑念珠菌对伊曲康唑耐药。所有的念珠菌对制霉菌素都敏感。SENTRY抗菌监测项目报道，光滑念珠菌对氟康唑的耐药率达8.8%，对棘白菌素的敏感性降低，而且出现交叉耐药[2]。本研究分离的白念珠菌对氟康唑、咪康唑、克霉唑、伊曲康唑和制霉菌素的耐药率分别为1.2%（1/83）、8.4%(7/83)、1.2%(1/83)、4.8%（4/83）和0.0%(0/83)；光滑念珠菌23株，对氟康唑和伊曲康唑的耐药率分别为26.1%(6/23)和8.7%(2/23)，对咪康唑、克霉唑和制霉素不存在耐药菌株，光滑念珠菌对氟康唑的耐药率明显高于白念珠菌对氟康唑的耐药率。本研究中，所有念珠菌对制霉菌素均不耐药。Fan等在对283名复杂性VVC患者应用氟康唑和制霉菌素进行体外抗真菌药物敏感性和临床疗效的研究中，共分离出287株念珠菌，对制霉菌素全都敏感。Beltaire等对1999年～2011年念珠菌对抗真菌药物敏感性进行回顾性分析，念珠菌对多烯类抗真菌药物的敏感率为100%，基于研究结果，多烯类抗真菌药物是治疗真菌感染的首选药物。多烯类抗真菌药物是一种广谱抗真菌药物，与真菌细胞膜上的麦角固醇结合，增加细胞膜的通透性，导致真菌死亡[3]。

有研究表明，无症状妇女和急性VVC患者念珠菌基因型存在差异。念珠菌对不同药物的耐药机制不同，对唑类药物耐药是耐药菌细胞膜上外排泵基因的过度表达，唑类药物作用的靶酶变异、念珠菌生物被膜的形成。外排泵基因过度表达导致14-a羊毛甾醇去甲基化酶作用位点处药物浓度降低。耐药相关基因CDR1、CDR2的存在是导致念珠菌对大多数唑类耐药的重要机制，念珠菌GgCDR1、CgCDR2与唑类药物交叉耐药有关。本研究念珠菌CDR1、CDR2阳性表达率分别62.5%（75/120）和60.8%（73/120）,与文献[4]报道一致。念珠菌无论是耐药还是敏感，都存在CDR1和CDR2外排基因的表达，都有可能出现对抗真菌药物的外排，但外排能力的产生并不代表念珠菌耐药现象的出现，耐药现象是在多种机制共同作用下逐渐形成的[5]。

（作者单位：浙江省台州市第一人民医院妇产科）

[1]廖伟娇，郭晓婧，江洁华，等．123株白色念珠菌耐药基因CDRl 和CDR2表达研究[J]．中国热带医学，2008，8(8)：1828—1830．

[2]侯欣，徐英春，赵玉沛. 念珠菌耐药机制研究进展.现代检验医学杂志,2016,1:60-64.

[3]刘朝晖，王晓莉，廖秦平.复发性外阴阴道假丝酵母菌病的菌群分析与治疗.实用妇产科杂志,2009,25(12):730～732.

[4]雷云. 复发性外阴阴道假丝酵母菌病致病菌的药敏及其基因分布.广西医学，2014,3:288-290.

[5]张丽梅，谭皓妍，徐韫健，等.耐药基因CDR1、CDR2、ERG11、CaMDR1和FLU1在假丝酵母菌株中的分布情况，山东医药，2013，53（25）：20-22.

卢彩玲