多基因序列比较分析海南橡胶树炭疽病菌遗传种群

林春花 董瑛 刘文波 缪卫国 郑服丛

摘 要 橡胶树炭疽病是橡胶树上一种重要叶部病害，已知病原菌有胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌，它们是复合种群，群下种类多，遗传多样性丰富。利用ITS、GAPDH、CHS-1和ACT基因的部分序列，对来自海南省橡胶树不同植胶地点的16株炭疽菌，进行基因谱系比较分析。结果显示，采用单基因部分序列和4基因拼接序列都能将供试菌株分为两大类群：胶孢炭疽菌复合群和尖孢炭疽菌复合群。其中，来自于儋州HN06、乐东志仲HN02和保亭大本HN16的3个菌株聚类于尖孢炭疽菌复合群，其余13个菌株聚类于胶孢炭疽菌复合群。4基因拼接序列分析还可以看出，胶孢炭疽菌复合群下参试的9个菌株都属于分支Musae Clade。但是采用单基因或4基因拼接序列均不能将海南橡胶炭疽菌鉴定到复合群下的具体种。

关键词 橡胶树；炭疽病菌；多基因序列分析法；遗传多态性

中图分类号 S763.7 文献标识码 A

Abstract Colletotrichum gloeosporioides and Colletotrichum acutatum had been reported as the pathogens of the Rubber anthracnose， which is one of the main leaf diseases of rubber tree in China. But both of C. gloeosporioides and C. acutatum are Colletotrichum species complex with multiple species or subspecies and abundant genetic diversity. In the study， 16 strains of rubber anthracnose pathogen were isolated from different rubber tree patations in Hainan Province， and the molecular phylogenetic tree of them was analyzed comparatively based on partial sequences of single gene and concatenated sequences of the ITS， ACT， CHS-1 and GAPDH genes. The results showed that the phylogenetic tree of the isolates from rubber trees were divided into two class groups of C. gloeosporioides complex and C. acutatum complex， no matter the trees were built using single gene or combinations of 4 genes. Among them， three of the 16 isolates were species within the C. acutatum complex and others were species within the C. gloeosporioides complex. In the group of C. gloeosporioides complex， all of 9 isolates of rubber anthracnose pathogen analyzed belonged to cluster of“Musase Clade”. However， the isolates cannot be identified as detail species within C. gloeosporioides complex or C. acutatum complex on account of the low bootstrap support values.

Key words Rubber tree； Colletotrichum spp.； Multiple-gene phylogeny； Genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.05.015

炭疽菌（Colletotrichum spp.）真菌引起的炭疽病是世界范围内农业生产中发生最为普遍、危害较重的植物病害[1]。炭疽菌种类繁多，遗传多态性丰富，其较为常见的致病种是胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌，都具有集合种群和复合种的特征，复合群下可分为多个种，并且种间菌株间变异大，有多个专化型或生理小种[2-3]。ITS序列作为真菌通用条形码基因对复合菌研究有用，但因胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌复合种群中，种之间ITS序列基因碱基变化小，因此在解决胶孢炭疽菌复合种内的遗传关系上不可靠[1]。2012年英国与新西兰科学家采用多基因序列分析法对前期鉴定为胶孢炭疽菌（约400株）和尖孢炭疽菌（331株）进行鉴定，发现2个种均可以分为多个亚群，并且重新鉴定获得多个新种，这些新种具有胶孢炭疽菌或者尖孢炭疽菌的形态特征，但多基因序列间存在较大差异[2-3]。近年来，越来越多的科学家倾向于利用多个基因序列来开展炭疽菌的鉴定和遗传多样性分析。

橡胶炭疽病在中国普遍发生，已知病原菌有尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌[4-6]。现已有的研究结果表明，2种炭疽菌在生物学特性、抗药性和菌落形态上都存在较大差异[7-8]。关于橡胶树2种炭疽菌的分子鉴定和遗传多态性也有研究，分子鉴定主要采用核糖体DNA转录间隔区（rDNA-ITS）单基因序列分析[4，10]， 遗传多态性分析也主要基于rDNA-ITS和随机扩增DNA多样性（RAPD）等进行。如郑肖兰等用RAPD法对来自海南橡胶、香蕉等17个炭疽菌进行分析[9]。刘先宝等利用ISSR和RAPD分子标记技术对来自海南、广东、广西和云南等垦区橡胶树的21株尖孢炭疽菌进行遗传多态性分析[10]。研究结果均显示炭疽菌具有丰富的种内遗传多样性，种内亲缘关系较远。而利用多基因序列法分析中国橡胶炭疽菌种群关系尚未见报道。因此，笔者利用ITS（Internal transcribed spacer）、CHS-1（Chitin

synthase）、GAPDH（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和ACT（Actin）基因的部分序列对16株分离自海南橡胶垦区的炭疽菌进行基因谱系比较分析，比较4个单基因和拼接序列分析分别可获悉的炭疽菌种群情况，该结果可了解引起海南橡胶炭疽病病原菌所属类群，揭示复合种群下的遗传多态性。

1 材料与方法

1.1 材料

橡胶炭疽病菌的采集、分离和致病力测定；于2014年12月在海南省橡胶垦区随机采集炭疽病叶带回实验室，从病叶的病健交界处剪取约5 mm×5 mm病组织；用70%乙醇消毒45～60 s，然后转入0.1%升汞消毒1～2 min，再用无菌水冲洗3～4次，用灭菌滤纸吸干水分后放置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上培养，分离获得的菌株经单孢纯化，室温下培养并保存。将各菌株利用科赫氏法则进行致病力鉴定，分离出具有致病力的炭疽菌有16株。具体详见表1。

1.2 方法

1.2.1 菌丝收集和基因组DNA提取 参照林春花等[4]的方法收集菌丝和提取DNA。

1.2.2 基因克隆 分别利用ITS、CHS-1、GAPDH和ACT基因的部分序列引物对16株橡胶树炭疽菌基因组DNA进行PCR扩增，引物序列、退火温度、延伸时间等详见表2。每个PCR体系总体积为25 μL，包括0.1 μL Taq聚合酶（5 U/μL），2.5 μL PCR Buffer（含Mg2+），2 μL dNTPs，引物（10 μmol/L）各1 μL，1 μL模板DNA， 以灭菌ddH2O补足25 μL。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像系统分析片段大小，目的片段经回收、克隆后送华大基因科技股份有限公司测序。

1.2.3 橡胶炭疽菌菌类分析 选用2012年Damm 等[3]所述的尖孢炭疽菌复合群里29个种和2012年Weir等[2]报道的胶孢炭疽菌复合群里的24个种为参考菌株，依据参考文献提供序列登录号，并从GenBank中下载相应的ITS、CHS-1、GAPDH和ACT基因序列。胶孢炭疽菌复合群参考菌种有：C. fructicola（strain_C1275.7）、C. nupharicola（strain_

C1275.25）、C. alienum（strain_C824）、C. musae（strain_

CBS_116870）、C. aenigma（strain_C1253.4）、C. siamense（syn.C. hymenocallidis）（strain_C1316.5）、C. aeschynomenes（strain 3-1-3）、C. tropicale（strain_

5101）、C. queenslandicum（strain_ICMP_1778）、C. salsolae（strain_C1314）、C. gloeosporioides（strain_

IMI_356878）、C. alatae（strain_C1275.5）、C. theobromicola（syn.C. gloeosporioides f. stylosanthis（strain_C1270.1）、C. xanthorrhoeae（strain_C1271）、C. horii（strain_C1180.1 ）、C. aotearoa（strain_C1282.4）、C. ti（strain_ICMP4832）、C. kahawae subsp.kahawae（strain_C1266.1）、Glomerella cingulata“f.sp.camelliae”（strain_ICMP10643）、C. clidemiae（strain_C1317.1）、C. psidii（strain_CBS145.29）、C. cordylinicola（strain_

C1315.1）、C. theobromicola（strain_C1316.13）、C. asianum（IC MP_18580）；尖孢炭疽菌复合群参考菌种有：C.lupini（CBS_109225）、C. tamarilloi（CBS_

129814）、C.costaricense（CBS：330.75）、C. cuscutae （IMI：304802）、C. limetticola（CBS：114.14）、C. nymphaeae（CBS：515.78）、C. scovillei（CBS：126529）、C. guajavae （IMI：350839）、C. cosmic（CBS：853.73）、C. simmondsii （CBS：122122）、C. laticiphilum（CBS：112989）、C. fioriniae （CBS：128517）、C. acutatum（CBS：112996）、C. godetiae（CBS：133.44）、C. pyricola（CBS_128531）、C. rhombiforme（CBS：129953）、C. salicis（CBS_607.94）、C. kinghornii（CBS：198.35）、C. acerbum（CBS：128530）、C. austral （CBS_116478）、C. brisbanense（CBS_292.67）、C. chrysanthemi（IMI_364540）、C. indonesiense（CBS_

127551）、C. johnstonii（IMI_357027）、C. melonis（CBS_

159.84）、C. paxtonii（IMI_165753）、C. phormii（CBS_

118194）、C. sloanei（IMI_364297）、C. walleri（CBS_

125472）。并采用C. orchidophilum（CBS：632.80）和C. pseudoacutatum（CBS_436.77）的相应序列作为参考外群[2-3]。

将测序所得的基因部分序列提交NCBI数据库，获得序列号（见表1）。用MEGA 6.0软件经“W”功能比对并校正后，采用bootstrap test（1 000重复）构建系统进化树，遗传距离用Neighbor-Joining法进行计算。对各菌株分别进行ITS、ACT、CHS-1、和GAPDH单基因聚类分析。同时，将各菌株的基因按照ITS-ACT-CHS-1-GAPDH顺序进行序列拼接后，用上述方法构建系统进化树，分析单基因与多基因序列拼接聚类结果的异同及橡胶树炭疽菌种群差异。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离及致病力测定

从海南琼中、乐东、白沙、儋州、琼中、屯昌、澄迈、文昌、琼海、万宁、保亭橡胶林中（含苗圃）采集橡胶树炭疽病病样，经分离纯化获得形态特征疑似炭疽菌的菌株16株，回接试验表明，这16株真菌都能引起类似症状，说明参试菌株为橡胶树炭疽菌致病菌。这16株炭疽菌的地理分布和致病能力见表1。来自琼中加钗农场的菌株HN01和来自保亭新星农场的HN14菌株在致病力回接时表现为弱致病力，在叶片上形成的菌落较小；来自澄迈红光农场的HN12和万宁山根HN10菌株表现出强致病力；其余菌株表现中等致病力。

2.2 ITS、ACT、GAPDH和CHS-1单基因部分序列聚类分析

16株橡胶炭疽病菌用ITS基因部分序列引物ITS1/ITS4、ACT基因部分序列引物ACT-512F/ACT-783R、CHS-1部分序列引物CHS-79F/CHS-354R、GAPDH部分序列引物GDF/GDR分别扩增出1条大小为574～583 bp、272～282 bp、297～298 bp和272～280 bp的条带。序列克隆测序后，与参考基因进行比对，截取同样位点的序列提交给NCBI数据库，获得序列号（表1）。

根据ITS、ACT、CHS-1和GAPDH部分序列分别做聚类分析，结果见图1～4。除了用GAPDH和ACT部分序列不能很好的将外群菌株（CBS：632.80）区分在外，4个基因都能将参考菌株和参试菌株聚成2大分支：胶孢炭疽菌复合群（分支Ⅰ）和尖孢炭疽菌复合群（分支Ⅱ）。并且4个基因聚类结果都能将来自于儋州HN06、乐东志仲HN02和保亭大本HN16的3个菌株聚类于尖孢炭疽菌复合群，其余13个菌株聚类于胶孢炭疽菌复合群。该结果说明了采用4个单基因部分序列聚类分析方法都能用来区分橡胶炭疽菌是否归属于胶孢炭疽菌复合类群或尖孢炭疽菌复合类群。

但4个基因聚类图各分支情况也有不同，并不能将各复合类群中的种区分开来，且各分支间的支持率也不高。尤其是在ACT（图2）和GAPDH（图3）聚类图中，甚至不能将外群菌株（CBS：632.80）很好的区分在外。基于ITS部分序列聚类图中（图1），胶孢炭疽菌复合群中可以将HN01、HN04、HN05、HN11和HN13与胶孢炭疽菌C. gloeosporioides菌株IMI_356878聚为一类（支持率为34%）， 但HN03、HN09、HN14、HN15与C.fructicola（菌株C1275.7）和C. aeschynomenes（strain 3-1-3）聚为一类，其余菌株也是与多个参考菌株聚于一类。在尖孢炭疽菌复合群中，3株橡胶炭疽菌不能与尖孢炭疽菌的多菌种区分开来。

基于ACT部分序列聚类图中（图2），来自海南的16株炭疽菌无论是在胶孢炭疽菌复合群中，还是在尖孢炭疽菌复合群中，都不能与某些种较好的聚在一起，他们分散在各个种间。

基于GAPDH部分序列聚类图中（图3），胶孢炭疽菌复合群中HN01、HN04、HN05、HN07、HN08、HN13与参考菌株strain_3-1-3（C. aeschynomenes）和strain_C1316.5遗传距离较近（支持率为39%），其他菌株与多个种聚在一起。在尖孢炭疽菌复合群中，3个菌株序列很相近，92%的支持度单独聚为一类，与其他种间聚类的支持度都较低。

基于CHS-1部分序列聚类图中（图4），在胶孢炭疽菌复合群中，HN12、HN08、HN05与ICMP_18580聚为一类，支持率有67%；HN03、HN09、HN14、HN15这4个菌株与Strain_C1275.7聚在一起，其余菌株与多个种区分不开。在尖孢炭疽菌复合群中的3个橡胶菌株与CBS：515.78遗传距离最近，支持度为33%。

因此，利用ITS、ACT、GAPDH和CHS-1单个基因序列都可以将橡胶树炭疽菌归属于胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌复合类群中，但不能将各复合类群中的种区分开来。

2.3 ITS-ACT-CHS-1-GAPDH四基因聚类分析

根据ITS-ACT-CHS-1-GAPDHS这4个基因序列拼接后聚类，结果见图5，与各单基因类似，除了外群参考菌株C. pseudoacutatum（CBS436.77）和 C. orchidophilum（CBS632.80）外，参考菌株和参试菌株分聚为2大分支，且HN02、HN06和HN12菌株隶属于尖孢炭疽菌复合群，其他菌株属于胶孢炭疽菌复合群。

在尖孢炭疽菌复合群中，根据这4个基因部分序列拼接聚类结果，在所有参试的尖孢炭疽菌种中，虽然各分支的支持度不高，但是各个种分布情况与Damm等[3]文章中利用6个基因（ITS，ACT，TUB2，CHS-1，GAPDH，HIS3）部分序列比对结果基本相似。因此，采用这4个基因部分序列基本能反应尖孢炭疽菌复合群下各种的遗传情况。根据聚类图可以看出，HN02、HN06和HN12的3个菌株与C. scovillei（CBS：126529），C. guajavae（IMI：350839）和C. chrysanthemi（IMI_364540）聚在1个小分支上，遗传距离最近，而与C. acutatum（CBS_112996）距离较远。

在胶孢炭疽菌复合群中，虽然各分支的支持度不高，但群下各种的遗传聚类图与Weir等[2]文章中利用8个基因（ACT、TUB2、CAL、CHS-1、GAPDH、GS、ITS和SOD2）部分序列比对结果相似，都将胶孢炭疽菌复合群下的种分为2大分支：Musae Clade和Kahawae clade。因此，采用这4个基因部分序列基本能反应胶孢炭疽菌复合群下各种的遗传情况。从聚类图中可以看出，来自橡胶树9株炭疽菌与C. fructicola（strain_1275.7）、C. nupharicola（strain_

1275.25）、C. alienum（strain_C824）、C. aenigma（strain_

1253.4）、C. siamense（strain_1316.5）、C. tropicale（strain_

5101）、C. aeschynomenes（strain_3-1-3）和C. asianum（ICMP_18580）聚为一起，这些种都属于Musae Clade。因此可以说明来自橡胶树的9个炭疽菌都属于Musae Clade分支。并且，从图5可以看出，HN03、HN14和HN15与菌株C. fructicola（ICMP_1275.7）遗传距离最近，支持度有61%，HN05、HN04和HN13与C. aeschynomenes（strain_3-1-3）聚在1个小分支中，推测海南橡胶树胶孢炭疽菌中可能有C. fructicola和C. aeschynomenes种。

3 讨论与结论

炭疽菌属下许多种的形态差异微小，例如分生孢子、附着胞形态相似，且形态特征易受环境因子的影响等，这些不稳定性都给炭疽菌单纯依据形态特征进行分类鉴定造成了很大困难。随着分子生物学手段的运用，尤其是ITS序列被作为真菌通用条形码基因以来[12]，许多炭疽病菌的病原菌都采用ITS序列鉴定。但由于ITS在该属系统性研究中的局限性，如对多数近缘种，构建的系统树在一些关键进化节点的支持率低，不能有效进行识别[13]。有学者认为利用ITS序列不能有效的用于种的识别，可能会导致错误的结论[14]。Taylor等[15]主张采用多基因序列分析法研究物种进化，且提出了phylogenetic species的概念。多基因序列综合分析技术的使用，使人们对炭疽菌属真菌的认识更为深刻、更为准确。2012年新西兰和英国科学家采用多基因序列对前期认为是胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌的菌株进行全面分析，成功的将近500株菌株重新准确鉴定，将原来认为是胶孢炭疽菌的156个菌株鉴定为22种和1个亚种，尖孢炭疽菌的331个菌株鉴定为31个种，并且发现了一些新种[2-3]。研究结果显示，胶孢炭疽菌和尖孢炭疽具有复合种群的特征，种内遗传分化多样，形态特征相似或相同的胶孢炭疽菌或尖孢炭疽菌复合群菌株间基因序列碱基存在较大差异，采用多基因序列分析法可以将胶孢炭疽菌复合群和尖孢炭疽菌复合群中的菌株鉴定到种。因此在炭疽菌种群分类上，根据不同需求可采用不同基因数量进行分析。

前期通过形态学方法鉴定或基于ITS序列的分子鉴定结果表明[4-5，10]，中国橡胶树病原菌有胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌2种，并且以胶孢炭疽菌为主[4]。随着胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌是复合群的提出，橡胶树炭疽病病原菌具体是属于复合群下哪个种，采用单基因序列和少数几个基因拼接序列分析可获得哪些种群关系等成为疑问。本研究对来源于海南橡胶垦区的16个炭疽菌株，比较分析ITS、GAPDH、ACT、CHS-1单基因部分序列或拼接序列的聚类结果。结果显示：无论是利用ITS、GAPDH、ACT和CHS-1基因单基因序列还是拼接序列都能区分胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌复合群；采用4个基因拼接序列还可看出，海南胶孢炭疽菌复合群下橡胶树炭疽菌都属于Musae Clade分支。该结果说明采用本文中的4个基因单基因序列均能很好的将橡胶炭疽菌鉴定到复合群水平，采用ITS、GAPDH、ACT和CHS-1基因拼接序列还可进一步将胶孢炭疽菌鉴定到Musae Clade类群。

Damm等[3]采用了6个基因分析尖孢炭疽菌复合群，Weir等[2]采用8个基因分析胶孢炭疽菌复合群。本文无论是单个基因序列或4个基因拼接序列聚类，都无法将菌株与具体单个菌株进行很好的聚类。虽然分析的基因数量少于参考菌株的来源文章，各分支支持度不高，但本文所示聚类树状图总体分布情况与参考文章所列相似，说明本研究结果具有可靠性。研究并未将参试的橡胶菌株归类于复合群下具体的种类，可能是由于测定基因数量不足。如要更好的鉴定橡胶炭疽菌所属种群，需要进一步测定更多的保守基因进行分析。

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