中国实验用小型猪生化标记检测研究

邵明英　王　皓　葛长利　陈其美　董　彬李训碧

（1海南职业技术学院，海南海口570000；2中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193；3山东蓝思种业股份有限公司，山东日照276800；4全国畜牧总站，北京100124）



中国实验用小型猪生化标记检测研究

邵明英1,2*王皓2,4*葛长利3陈其美3董彬3李训碧2#

（1海南职业技术学院，海南海口570000；2中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193；3山东蓝思种业股份有限公司，山东日照276800；4全国畜牧总站，北京100124）

摘要：本试验采用聚丙烯酰氨凝胶电泳法，对我国实验用小型猪生化标记实行相应的探究。收集五指山小型猪、贵州小型猪、广西巴马小型猪和山东莱芜猪等的血液样品，检测了不同品种猪碱性磷酸酶（APK）、转铁蛋白（Tf）、蛋白抑止物（Pi-1）、后白蛋白（Po-2）、葡萄糖6磷酸脱氢酶（G6PD）、乙醇脱氢酶（ADH3）、醛缩酶（ALDA）、碳酸酐酶（Ca）和谷氨酸脱氢酶（GLD）等9个生化标记位点。结果显示：所检测的4个品种猪、9个生化标记位点中的ADH3、GLD、ALDA三个位点电泳呈现单条带，不存在多态性；其他6个位点都存在多态性。此外，还发现G6PD和Ca两个位点在五指山小型猪、贵州小型猪、广西巴马小型猪品种和山东莱芜猪中表现型有明显不同。经对所统计数据与结果进行相应的分析与总结，确定了4个类型猪的遗传性变异、体系构造及种类之间的遗传联系等；并从此方向揭示了我国现存实验用小型猪的遗传多样性情况，丰富了我国地方猪种遗传资源数据库。

关键词：实验用小型猪；遗传多样性；生化标记；聚丙烯酰胺凝胶电泳；检测

我国具有丰富的猪种质资源，同时拥有独特而又丰富的小型猪资源[1,2]。小型猪的应用前景非常广阔，尤其是在比较医学领域：实验用小型猪以其来源清楚、体型小、耐近交、遗传稳定及遗传背景明确等独特优势，以及在心血管组织、消化组织、皮肤组织、骨组织生长、营养摄取、新陈代谢以及解剖结构等环节和人体比较相像，已逐渐成为医学研究中一种重要的动物模型[3,4]。

自20世纪80年代以来，我国已开始对小型猪资源的多领域开展研究，包括近交系培育、分子遗传学基础、生长发育规律、饲料营养代谢、血液生理生化指标、组织器官生理解剖、比较医学生物安全性及开发应用等[5-7]。基于我国地形、生态条件的多样性，我国小型猪品种在经过历代人工和自然选择后，已具有得天独厚的资源和条件。我国小型猪主要的品种有：海南五指山小型猪、云南小耳猪、贵州香猪、广西巴马香猪、甘肃合作猪、滇南小耳猪、乌金猪、青海藏猪等。尽管全球小型猪资源主要集中在中国和越南，但缺乏符合国际标准的实验用猪，已成为制约小型猪及其生物制品开发应用的主要因素。

生化标记是根据动物机体的生理情况作为遗传标记，基本上包含血型、血清蛋白以及同工酶等多个方面，是当前四大主要遗传标记之一。通过对动物体内蛋白、同工酶等的检测，评价动物品种内的遗传变异和品种间的亲缘关系。血液蛋白多态性（Protein Polymorphism）是一种常用的生化遗传标记，表示的是具备某一特定性能的血液蛋白质或者酶具有两种以上的遗传变异体[8]。

电泳是生化标记检测最常用的方法[9]，根据支持物不同可分为：纸电泳与凝胶电泳。聚丙烯酰氨凝胶电泳方式是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用方法，它具备以下特点：⑴当浓度含量达到一定程度时，凝胶呈现透明状，弹性效果较佳，机械功能较好；⑵同被分离物质不会产生相应的化学效果；⑶对pH值以及温度的范围较为稳固；⑷从大体上来看，基本不具有电渗效果，在浓度含量较高、操作流程相同的条件下，其样品的分离重复性较好；⑸样品极不容易进行分散，且使用的数量较少，灵敏程度能够达到1 μg；⑹凝胶的孔径可以进行调整，并可依照被分离物质的分子量选取与其相适应的浓度指标；⑺分辨率高。

本试验采用聚丙烯酰氨凝胶电泳法，对中国实验用小型猪生化标记进行研究。收集五指山小型猪、贵州小型猪、广西巴马小型猪以及山东莱芜猪等4个品种猪的血液当做样本，检测了不同品种猪的9个生化标记位点。本研究的开展将为我国矮小型猪种质资源挖掘和保护提供基础，为小型猪近交系的建立提供有力的参考依据，并促进试验用小型猪生化标记检测方法标准的制定。

1　材料与方法

1.1采样及样品的分离方法

使用前腔静脉采血法，收集五指山小型猪、贵州小型猪、广西巴马小型猪以及山东莱芜猪等4个品种猪的血液当做样本（表1）。

表1　采样品种及数量　（头）

每头猪采集血液10mL，肝素钠抗凝（肝素为100U/mL全血），在4℃的条件下，以1 000转/分钟的速度离心10分钟，并在此之后，获取上层的血浆。把下层血细胞进行洗涤，并以1 000转/分钟的速度进行离心，持续时间为10分钟，将上层液体除去，并再次进行洗涤。以上血浆与溶血液均保存在-20℃冰箱中备用。

1.2标记位点电泳检测试验

本试验采用垂直板聚丙烯酰氨凝胶电泳法检测了不同品种猪碱性磷酸酶（APK）、转铁蛋白（Tf）、蛋白抑止物（Pi-1）、后白蛋白（Po-2）、葡萄糖6磷酸脱氢酶（G6PD）、乙醇脱氢酶（ADH3）、醛缩酶（ALDA）、碳酸酐酶（Ca）和谷氨酸脱氢酶（GLD）等9个生化标记位点。凝胶浓度、缓冲液系统和相关电泳条件详见表2。

表2　凝胶浓度含量，缓冲液结构以及有关的电泳条件

1.3数据分析

应用生物学软件Mega3.1研究系统发生树，用GENEPOP估算等位基因频率等群体遗传学参数，用PIC统计工具进行多态性信息含量、位点杂合度等，用DISPAN软件包计算遗传分化系数、总群里杂合度、亚群体杂合度和遗传距离等。

2　结果与分析

2.1生化标记功能分析

本研究遵循下述几项规定选取了9个待测定的生化标记位点（表3）：参考在猪种类中和别的实验型生物中已经存在的生化标记位点；综合考察备选位点在染色体的分布，尽可能涵盖全部染色体，以其代表该品种动物的特点。

碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,AKP）是目前免疫诊断试剂产品最常用的标记酶之一，具有稳定性高、灵敏度高等优点。作为一种非特异性磷酸单酯酶，AKP能催化磷酸单酯的水解反应和磷酸基团的转移反应[10]。

转铁蛋白（Transferrin,Tf）又称运铁蛋白，是血浆中β球蛋白与铁结合蛋白的一种复合物，最早是从猪的血清中提取。一个转铁蛋白分子可以和两个Fe3+进行融合，并把Fe传递至骨髓中，对血红蛋白的形成起到一定的促进作用。除此之外，转铁蛋白还可以起到抗微生物的效果，并因其具有多种分子体系，所以在进行电泳之后，呈现出的区带也是多样化的[11]。

蛋白抑止物（Protease inhibitor,Pi-1），主要功能是中和由白细胞、肝脏和细菌释放出来的蛋白酶[12]。

后白蛋白（Postalbumin,Po-2）又称清蛋白，是血浆中含量最高的蛋白质，主要作用是维持血浆中胶体的渗透压。后白蛋白主要由肝脏合成，Po-2的浓度含量能够体现出肝脏组织的主要性能，其浓度的变化可以引发相应的继发症状。对血清后白蛋白的检测已广泛应用于生化标记监测[12]。

葡萄糖6磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphate dehydrogen ase,G6PD）存在于机体的血红细胞中，并帮助葡萄糖进行机体代谢，在此环节中将会生成NADPH，进而避免血红细胞受到氧化组织的侵害。G6PD可以协助血红细胞正常运行，保护血红细胞抵抗物质的积聚[13]。

乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase3,ADH3）基本上则是在肝脏部位产生，因此肝脏组织所患有的疾病或许同血清ADH活性存在密切的联系。采用分光光度方式对血清内ADH的活性进行评测，并且对这一指标进行深入的探讨，研究出其在疾病治疗过程中所起的作用。通过血清ADH活性测定，可以明确肝脏组织的各项功能是否存在问题。在对患有肝脏疾病患者血清内的ADH进行检测时我们可观察到，最终结果显著高于普通人群[14]。

谷氨酸脱氢酶（Glutamic acid dehydrogenase,GLDH）是众多线粒体酶中的一类，其中含有部分锌元素，该酶在人体内的分布具有一定规律，多出现在肝脏、心肌以及肾细胞中，其中，肝细胞中的GLDH活性最高，它催化谷氨酸脱氨生成α-酮戊二酸和氨的反应[15]。

醛缩酶（Aldolase,ALD）通常是指糖酵解途径中的1,6-二磷酸果糖醛缩酶，是Meyerhof等于1936年首先发现的。自1950年起，有关人员对哺乳动物细胞中的醛缩酶进行了持续的探究，结果发现动物体内共存在三类不同的ALD同工酶。血清ALD增高主要用于诊断肌肉和肝脏疾病，也可能是体内某些组织或器官发生病变所致。每个细胞中存在的ALD同工酶都具备其各自不同的独特性质，因此检测血清中的ALD同工酶能够有效增强细胞的独特性质，从而可以相对精准地找出发生病变反应的区域，及该区域发生病变反应的严重程度[16]。

表3　生化标记位点

碳酸酐酶（Carbonic anhydrase,Ca）属于金属酶的范畴，其中含有一定量的锌元素，这种酶的组成结构有一个重要特性，即在它的活性区域存在一种特殊的锌原子，且该锌原子是其发挥催化效应的必备元素。这种酶的催化机理为：促进二氧化碳进行水和反应，且该反应在一定条件下可逆，继而减少二氧化碳在植物叶肉组织中的流通障碍，有效推动二氧化碳向Rubi-sco的进一步流通，从而保证植物体内的羧化反应能够具备充足的反应物质。许多生物反应都涉及到了碳酸酐酶的催化作用，其中主要有pH调节、离子转换、CO2运输、呼吸作用及光合作用中的二氧化碳固定等[17]。

2.2生化位点遗传变化和遗传学差异

根据GENEPOP软件工具，对样品山东莱芜猪43头份、贵州小型猪44头份、五指山小型猪43头份、广西巴马小型猪73头份的生化位点出现频率进行统计（表4）。

表4　不同猪种生化位点的发生频率

2.3不同品种猪的遗传多样性信息

根据生物学软件pic统计工具，对样品山东莱芜猪43头份、贵州小型猪44头份、五指山小型猪43头份、广西巴马小型猪73头份的有效等位基因数（Ne）、多态信息含量（PIC）以及平均杂合度进行统计（表5）。

表5　四个品种的有效等位基因数、多态信息含量和杂合度

根据生物学软件GENEPOP和PIC统计工具，对样品山东莱芜猪43头份、贵州小型猪44头份、五指山小型猪43头份、广西巴马小型猪73头份进行统计，得出不同猪品种的遗传多样性信息（表6）。

根据生物学软件DISPAN，对样品山东莱芜猪43头份、贵州小型猪44头份、五指山小型猪43头份、广西巴马小型猪73头份得出4个品种猪的遗传距离（表7）。

3　讨论

3.1生化标记位点多态性

本文针对4个不同种类猪的9个生化标记位点进行了探究，详细叙述了中国4个不同区域性种类猪的遗传构型与遗传变异。探究成果显示，试验测定的9个生化标记位点中的ADH3、GLD、ALDA等3个位点电泳呈现单条带，不存在多态性；其他6个位点都存在多态性。此外，还发现G6PD和Ca两个位点在五指山小型猪、贵州小型猪、广西巴马小型猪品种和一个普通猪品种山东莱芜猪中表现型有明显不同（表4）。

Pi-1有2种基因型，且呈多态性，不同品种猪的Pi-1A和Pi-1B等位基因的频率有差异，在山东莱芜猪中Pi-1A和Pi-1B等位基因的频率分别为0.41666和0.58333，Pi-1B为优势基因；在贵州小型猪中Pi-1A 和Pi-1B等位基因的频率分别为0.41666和0.58333，Pi-1B为优势基因；在五指山小型猪中Pi-1A和Pi-1B等位基因的频率分别为0.82558和0.17441，Pi-1A为优势基因；在巴马小型猪中Pi-1A和Pi-1B等位基因的频率分别为0.77083和0.22916，Pi-1A为优势基因。

表6　遗传多样性信息

表7　4个品种猪的遗传距离

Po-2有2种基因型，且呈多态性，在山东莱芜猪中Po-2A和Po-2B等位基因的频率分别为0.57142和0.4257，Po-2A为优势基因；在贵州小型猪中Po-2A 和Po-2B等位基因的频率分别为0.15909和0.84090，Po-2B为优势基因；在五指山小型猪中Po-2A和Po-2B等位基因的频率分别为0.77906和0.22093，Po-2A为优势基因；在巴马小型猪中Po-2A和Po-2B等位基因的频率分别为0.94444和0.05555，Po-2A为优势基因。

Tf有多种基因型，且呈多态性[18]，在山东莱芜猪中，TfA、TfB、TfC和TfD的基因频率分别为0.26744、0.65476、0.05952和0.01190，TfB为优势基因；在贵州小型猪中，TfA和TfB等位基因的频率分别为0.32222和0.67045，TfB为优势基因；在五指山小型猪中，TfA、TfB、TfC和TfD的基因频率分别为0.29545、0.32558、0.16279和0.20930，TfB为优势基因；在巴马小型猪中，TfA、TfB、TfC和TfD的基因频率分别为0.28767、0.59722、0.06250和0.04861，TfB为优势基因。

AKP有2种基因型，且呈多态性，不同品种猪的AKPA和AKPB等位基因的频率有差异，在山东莱芜猪中，AKPA和AKPB等位基因的频率分别为0.13095和0.86904，AKPB为优势基因；在贵州小型猪中，AKPA 和AKPB等位基因的频率分别为0.04545和0.95454，AKPB为优势基因；在五指山小型猪中，AKPA和AKPB等位基因的频率分别为0.09302和0.90697，AKPB为优势基因；在巴马小型猪中，AKPA和AKPB等位基因的频率分别为0.10416和0.89583，AKPB为优势基因。

G6PD和Ca的分析同上。

3.2遗传多样性

已有研究表明，用于测量遗传变化的生化标记在种群内的平均杂合度需要维持在0.3～0.8的范畴内，否则就不具备一定的实践价值[19]。在该探究中生化标记在4个中国地方猪品种的平均杂合度维持在0.36～0.54的范畴内（表6），所以该探究运用采用的生化标记，能够有效适用于检测生物遗传多样化的相关研究中。

3.3遗传距离

遗传距离能够在一定程度上显示不同种类或者不同品系间亲缘关系的远近。按照有关遗传距离计算标准得到的规范距离为从0.0223～0.1112不等（表7），其中两品种间距离最近的是广西巴马小型猪和五指山小型猪（0.0223），五指山小型猪与贵州小型猪距离最远（0.1112）。

4　结论

动物生化标记是家畜遗传变异的直接反映。生化标记多样化和生物经济性状在遗传上具有一定的联系，且在理论上通常体现为3类不同的形式。除此之外，生化标记多样化不仅在理论上具有前瞻性的引导价值，在经济生产方面还存在一定的实际意义，能够适用于对生物种类的初期筛选及相关遗传育种工作，从而可有效推动我国遗传育种的发展进程。

本研究挑选了三个用于我国试验探究的小型猪品种，以及一个区域性品种猪的9个生化标记位点作为探究对象，并对其实行有效测定，通过蛋白凝胶电泳梯度检测了不同品种猪生化标记位点。通过生化标记检测成果的统计剖析及聚类，确定了4个不同种类猪的遗传变异、种群构型及不同种类间的亲缘关系。从生化标记多样化着手，深刻阐述了我国目前存在的小型品种猪的遗传多样化状况，丰富了我国地方猪种遗传资源数据库。

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#通讯作者：李训碧，助理研究员，E-mail:lixunbi0214@163.com

作者简介：邵明英(1976-)，女，河北人，畜牧师，主要从事畜牧兽医专业教学及科研工作；E-mail: mingshao2013@aliyun.com，Tel：0898-31930606

基金项目：中国农业科学院科技创新工程"（ASTIP-IAS05）；山东省泰山学者种业计划项目，863计划项目（2013AA102502）

收稿日期：2015-08-28

中图分类号：S828.8+9

文献标识码：B

文章编号：1673-4645(2016)02-0055-06

*共同第一作者：王皓（1981-），男，山东人，畜牧师，从事种畜禽遗传改良和生产经营管理工作，E-mail:2712wanghao@163.com，Tel：010-59194610