实时荧光PCR在食源性致病菌食物中毒应急处置中的应用

谭国浩 谭翰清

实时荧光PCR在食源性致病菌食物中毒应急处置中的应用

谭国浩 谭翰清

目的探讨实时荧光PCR在食源性致病菌食物中毒快速应急检测中的应用价值。方法对一起食物中毒进行流行病学调查，采集患者、相关食品、厨房工作人员和厨具拭子等标本，对前增菌液进行食源性致病菌实时荧光PCR快速筛查，同步进行分离培养。结果该事件39名聚餐人员中共有22人发病，罹病率达59.5%，对采集的36份标本进行实时荧光PCR和分离培养，其中8份患者标本和3份食品标本副溶血性弧菌实时荧光PCR阳性，并相应分离出11株血清型为O3∶K6的副溶血性弧菌。结论本次食物中毒是由冰鲜海鱼中的副溶血性弧菌污染熟食品而引起的，实时荧光PCR快速、特异、灵敏，可为食物中毒快速处置提供依据。

副溶血性弧菌;食物中毒;实时荧光PCR

副溶血性弧菌、沙门氏菌是主要的食源性致病菌［1］，可引起食物中毒，常规检测方法经过増菌、分离、生化试验、血清学反应等过程，操作繁琐，检测周期长，约5～7天，不利于突发公共卫生事件的应急处置。快速、特异、灵敏的实时荧光PCR技术在病原微生物检测中应用广泛［2-4］。本研究探讨实时荧光PCR技术在一起食源性致病菌引起的食物中毒中的快速检测应用效果。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与培养试剂

实时荧光PCR仪(LighCycler1.5)、核酸提取仪(西安天隆NP-960)、电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械一厂)等;胰大豆蛋白胨肉汤、缓冲蛋白胨肉汤、GN肉汤、3%NaCl碱性蛋白胨肉汤、碱性蛋白胨肉汤、7.5%NaCl肉汤、李斯特氏菌增菌液、B-P琼脂平板、血平板、HE平板、TCBS平板、血浆凝固酶试剂盒、肠杆菌生化鉴定试剂盒、弧菌生化鉴定试剂盒等増菌、分离、生化鉴定试剂均由广东环凯生物技术有限公司生产。

1.2 实时荧光PCR检测试剂

磁珠法DNA/RNA快速提取试剂盒(广州华银医药科技有限公司);常见的食源性致病菌实时荧光PCR检测试剂盒包括了:金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、单核增生李斯特氏菌、肠出血性大肠O157∶H7(深圳生科源生物技术有限公司)。

1.3 样本采集与前处理

食物中毒应急队员到现场开展流行病和卫生学调查，追踪病例和个案调查。根据现场调查情况，用无菌棉签采集患者和厨房工作人员肛拭子、环境拭子，放置5mL TSB保存液，无菌瓶或样本袋子采集可疑引起食物中毒的留样食品，并在2 h内迅速送回实验室。检验人员收到样本后，立即开展样本的前增菌实验，37℃温箱培养6～8 h。

1.4 DNA提取与实时荧光PCR检测

取前增菌后的样本200 μL，采用DNA/RNA快速提取试剂盒(磁珠法)提取核酸DNA，在NP-960核酸提取仪上进行，30min可完成提取。按照实时荧光PCR检测试剂盒说明书，分别配制沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌等常见食源性致病菌实时荧光PCR反应体系，在实时荧光PCR仪上设置循环条件如下:95℃预变性2min;95℃变性10 s、60℃延伸40 s(收集荧光)，40个循环。

1.5 传统方法分离培养

按照食品安全国家标准及现行有效的微生物检验技术规范和相关传染病诊断标准进行食源性致病菌分离鉴定，对实时荧光PCR阳性的标本进行重点分离，鉴定结果与实时荧光PCR方法比较。

2 结果

2.1 流行病和卫生学调查概括

本次食物中毒集中发生在某公司在该酒家进行聚餐的39名员工中，餐后22人相继发病，以腹痛、腹泻、恶心、呕吐、发热为主，罹病率达59.5%，潜伏期最短1.5 h，最长25 h，平均潜伏期约12 h。个案调查发现，15名发病的员工均进食了聚餐的各类食物，2名无发病的员工没有进食或很少进食餐前小吃、卤水拼盘、扣肉和鱼食物。该餐前的所有餐次，员工各自在家进餐，其家属未见发病，且聚餐前均无另外进食。对酒家厨房的卫生学调查发现，熟食间冰箱内有冰鲜海鱼、生鲜鸡肉与卤熟食物混放。

根据现场调查情况，采集了患者肛拭13份、酒家厨房工作人员肛拭5份、手拭1份，厨房用具容器和工作台物表涂抹5份、相关食物12份(咸香鸡脚、卤大肠、熟食间冰鲜海鱼、麻油、豉油、卤牛展、卤掌翼、卤鸭掌、卤鸭头、芫茜葱、潮式富贵拼、白切鸡)。

2.2 实时荧光PCR结果

所采集的标本经TSB温箱培养6 h后，进行常见的食源性致病菌实时荧光PCR检测，包括沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、大肠杆菌O157、副溶性血弧菌。结果显示，36份标本中有11份副溶血性弧菌核酸扩增阳性，其中包括8份患者样本和3份食品标本(图1、图2)，食品样本分别为冰鲜海鱼、咸香鸡脚、卤大肠，其它食源性致病菌实时荧光PCR检测结果均为阴性。

图1 患者标本副溶血性弧菌实时荧光PCR扩增结果图

图2 食物标本副溶血性弧菌实时荧光PC扩增结果图

2.3 传统细菌分离鉴定结果

同时按现行有效的微生物检验技术规范和相关传染病诊断标准进行食源性致病菌分离鉴定，检测项目包括了沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、蜡样芽胞杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌。重点分离实时荧光PCR阳性的标本，以副溶血性弧菌为重点目标，按食品安全标准进行副溶血性弧菌分离、生化反应、血清学试验。结果，从实时荧光PCR阳性的8份患者样本和3份食品标本中检出生物学特性一致的副溶血性弧菌，血清型为O3∶K6，其中食物标本为咸香鸡脚、卤大肠、熟食间冰鲜海鱼。副溶血性弧菌实时荧光PCR检测结果阴性的标本均未分离出副溶血性弧菌，两种方法检测结果完全一致，其分布情况见表1。

表1 两种检测方法在各类标本中对副溶血性弧菌的结果分布

2.4 食物中毒结果判定

根据现场流行病学调查、结合临床表现以及实验室检验结果进行综合分析，依据《食物中毒诊断标准及技术处理总则》［5］、《副溶血弧菌食物中毒诊断及处理原则》［6］可判定本次疫情为一起副溶血性弧菌污染食物引起的食物中毒。实时荧光PCR检测结果为疫情早期快速处置提供了依据，也为后续分离培养工作指明方向，提高疾病预防控制工作效率。

3 讨论

近年来，我国食品安全问题依然形势严峻，食源性致病菌污染为引起食物中毒的主要原因，集体食堂、家庭和饮食服务单位是中毒的高发场所。副溶血性弧菌(Vibrio Parahaemolyticus，VP)是一种嗜盐性细菌，属弧菌科(Vibrio)弧菌属，主要存在于近海岸的海水、海底沉积物和鱼类、虾类、贝类、牡蛎等海产品中，人们多因食用被本菌污染而又未煮熟的海产品而引起腹泻症状，在细菌性食物中毒中所占比例高，我国每年都有副溶血性弧菌引起食物中毒的报道，发病率呈上升趋势［7-8］。往年主要集中发生在沿海地区，但随着海鲜市场经贸往来、区域一体化、物流的发展，使得该类食物中毒在全国范围内均可发生。而引起副溶血性弧菌聚集性食物中毒的主要原因多为餐饮厨房卫生管理混乱，生熟食物混放而交叉感染，夏季温度升高，细菌更容易繁殖。在本次食物中毒中，引发中毒的原因是酒家食品安全卫生管理不规范，冰鲜海鱼与熟食混放，其所含有的副溶血性弧菌间接污染了熟食，某公司22名员工共同进食了受污染的食物而引发了此次食物中毒。

细菌性食物中毒常规检测方法经过増菌、分离、生化试验、血清学反应等过程，操作繁琐，检测周期长，约5～7天，而且引起食物中毒的细菌种类较多，每一个细菌都要开展分离所花费的时间特别长，耗费大量的人力和物力，不利用疫情的快速处置。实时荧光PCR技术具备快速、特异、灵敏、简便等特点，可在数小时内出初步的结果，指明了引发食物重点的罪魁祸首，因此，该技术在细菌性食物中毒快速检测中被广泛应用［9-11］。在本次食物中毒应急处置过程，应用实时荧光PCR技术对患者标本、可疑食品进行常见食源性致病菌进行快速筛选，结合传统细菌分离鉴定技术，根据实时荧光PCR检测结果，缩少了致病菌的范围，集中有限的实验室力量，对副溶血性弧菌核酸扩增阳性的标本开展细菌分离、培养、鉴定工作，使实验人员可集中精力在种类繁多的标本中尽快地分离出引起食物中毒的病原菌，避免了其它细菌的干扰，提高工作效率，快速地为疫情控制处理提供科学准确的病原学依据。

［1］徐方旭，刘诗扬，兰桃芳，等.食源性致病菌污染状况及其应对策略［J］.食品研究与开发，2014(1):98-101.

［2］谭翰清，谭海芳，蔡建生，等.克罗诺杆菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR在食品安全风险监测中的应用［J］.现代预防医学，2016，43(6):1005-1007.

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［4］金玉娟，甘莉萍，杨 慧，等.双重实时荧光PCR检测副溶血性弧菌和创伤弧菌方法的建立［J］.热带医学杂志，2014，14(10):1296-1299，1302.

［5］中华人民共和国卫生部.食物中毒诊断标准及技术处理总则: GB14938-1994［S］.1994.

［6］中华人民共和国卫生部.副溶血弧菌食物中毒诊断及处理原则:WS/T81-1996［S］.1996.

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［9］刘恕安，李 荔，谭伟煊，等.广州市白云区68起食物中毒结果分析［J］.现代医院，2014，14(7):38-40.

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Study for the Application of Real-Time Fluorescence PCR in Emergency Disposal of Food Poisoning Caused by Food-Borne Pathogenic

TAN Guohao，TAN Hanqing

ObjectiveTo discuss the value of real-time fluorescence PCR applied in the rapid detection of food poisoning caused by food-borne pathogenic.MethodsAccording Field Epidemiology study for one case of food poisoning，samples were collected from patient，food，related waiter and cooking-tool，and tested by real-time PCR and conventional culture method，simultaneously.ResultsThe attack rate was59.5%for22 people got sick in39 people who had lunch together.Vbrio parahaemolyticus was detected in eight patient and three food-samples out of thirty-six samples by real-time fluorescence PCR and conventional culture method.The serotype of11 strains of vibrio parahaemolyticus was O3∶K6.Conclusion This case of food poisoning was caused by vibrio parahaemolyticus which contaminated from raw fish to cookedfood.The real-time fluorescence PCR was rapid，specific and sensitive，providing a basis for disposal of food poisoning.

Vibrio Parahaemolyticus;Food Poisoning;Real-Time Fluorescence PCR

Guangning County Center for Disease Prevention and Control，Guangning526300，China

R446.5;R155.3+1

:Adoi:10.3969/j.issn.1671-332X.2016.12.023

谭国浩:广宁县疾病预防控制中心 广东广宁 526300

谭翰清:肇庆市疾病预防控制中心 广东肇庆 526060

谭翰清