pEGFP-prohibitin真核表达重组质粒的构建及其在人肝癌细胞系Hep G2中的表达

翟嵩 孙明珠 王文俊 李亚萍 张欣 李梅党 双锁



pEGFP-prohibitin真核表达重组质粒的构建及其在人肝癌细胞系Hep G2中的表达

翟嵩 孙明珠 王文俊 李亚萍 张欣 李梅党 双锁

【摘要】目的 构建pEGFP-prohibitin真核表达质粒，并鉴定其在pEGFP-prohibitin转染的人肝癌细胞系Hep G2中的表达。方法 采用高保真PCR扩增获得prohibitin的全长编码序列，构建真核表达载体pEGFP-prohibitin，并通过基因测序和BLAST比对鉴定重组质粒；提取pEGFP-prohibitin和pEGFP-N1质粒，并通过TurboFect转染试剂转染Hep G2细胞；采用实时PCR和Western印迹方法分别在MRNA水平和蛋白质水平检测prohibitin蛋白在转染后Hep G2细胞中的表达。结果 成功构建pEGFP-prohibitin真核表达重组质粒，并将其成功转染Hep G2细胞；pEGFP-prohibitin转染组细胞prohibitin的表达量比空载转染组和未转染组细胞明显增加。结论 成功构建真核表达载体pEGFP-prohibitin，并证明抗增殖蛋白prohibitin在pEGFP-prohibitin转染人肝癌细胞系Hep G2中高表达。

【关键词】prohibitin蛋白；基因表达；重组质粒；转染

抗增殖蛋白prohibitin属于细胞膜蛋白超家族，是一种正常人体细胞内广泛存在的多功能蛋白［1］，在物种间高度保守［2］。prohibitin为线粒体分子伴侣蛋白，有利于维持线粒体的形态和功能，异常表达可引起线粒体损伤，从而可能启动细胞内源性凋亡［3］。近年来研究发现，prohibitin与多种疾病的发生发展有着密切的关系，尤其是在肝脏疾病的发生发展中起关键作用［4］。应用蛋白质组学技术研究发现，prohibitin在 HCB体外细胞培养系统表达上调［5］。通过对其功能的研究将有助于进一步认识肝脏疾病的发生机制，从而为临床治疗提供一个新的靶点。但到目前为止，prohibitin高表达对于HCV所导致的肝细胞凋亡中所发挥的生物学影响及其具体作用机制尚不清楚，本研究为了进一步探讨prohibitin高表达的生物学效应，构建了真核表达重组系统，并对pEGFP-prohibitin转染人肝癌细胞系Hep G2中高表达进行鉴定，为进一步的生物学功能研究提供依据。

材料和方法

一、材料

人肝癌细胞系Hep G2由西安交通大学医学院生化教研室保存。真核表达质粒pEGFP-N1购自美国BDBiosciences Clontech公司；Top 10化学感受态细胞购自德国Qiagen公司；限制性内切酶HindIII、限制性内切酶KpnI、DNA连接试剂盒、反转录第一链cDNA合成试剂盒、SYBR○RPremix Ex TaqTMII、电泳用琼脂糖均购自日本Ta KaRa公司；高保真PCR试剂盒、TurboFect Transfection Reagent购自美国Therm o公司；HRP标记的羊抗兔Ig G抗体、兔抗人prohibitin多克隆抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体购自美国Santa公司。

二、细胞培养

人肝癌细胞系Hep G2细胞使用含10％胎牛血清的DMEM高糖细胞培养基，置于37℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养，严格无菌操作，每天换液1次。电子显微镜下观察细胞密度达到80％以上时即可进行细胞传代，严格按照细胞培养传代方法，2～3 d按1∶1比例传代1次。

三、细胞总RNA提取

第一链cDNA反转录合成及prohibitin基因全长编码序列扩增具体实验方法参考文献［6］；按照琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒说明进行目的DNA片段的纯化和回收。回收的DNA片段，紫外分光光度仪测定浓度后，-20℃保存备用。

四、pEGFP-prohibitin真核表达重组质粒的构建

选取含有CMV启动子的pEGFP-N1质粒载体及其多克隆位点，根据Omega去内毒素质粒中提试剂盒说明进行pEGFP-N1质粒抽提，抽提好的质粒-20℃保存备用。应用限制性内切酶HindIII和KpnI分别消化纯化回收的目的基因片段，应用限制性内切酶HindIII和KpnI消化pEGFP-N1质粒；根据DNA连接试剂盒说明，将双酶切后的pEGFP-N1与prohibitin片段连接，使之成为重组质粒pEGFP-prohibitin。连接产物转化Top10感受态细胞，转化的菌液涂布于具有卡那霉素抗性的LB平板培养基，37℃倒置过夜培养。经卡那霉素抗性筛选出阳性菌落，挑取5个菌落分别接种于卡那霉素阳性的LB液体培养基中，37℃振荡过夜，提取质粒，方法同前。

五、PCR鉴定重组质粒pEGFP-prohibitin

将重组质粒pEGFP-prohibitin进行PCR，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳观察能否扩增得到约819 bp的目的DNA，以此鉴定prohibitin基因片段是否插入pEGFP-N1载体，是否与pEGFP-N1载体成功连接。将PCR鉴定为阳性的克隆送北京天根生化科技有限公司测序，通过NCBI数据库在线软件BLAST将测序结果进行序列一致性比对。细胞转染具体方法见参考文献［7-9］。

六、实时PCR检测prohibitin MRNA

使用SYBR○RPremix Ex TaqTMII试剂在Bio-Rad iQ5实时PCR仪上进行。引物由Ta KaRa公司合成（PAGE级），prohibitin：上游5′-AAACAGGTGGCTCAGCAGGAA-3′，下游5′-CAGTGAGTTGGCAATCAGCTCAG-3′。GAPDH：上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游5′-TGGTGAAGACGCAGTGGA-3′。反应体系25μL：2×SYBR○R

Premix 12.5μL，上下游引物各1μL，模板cDNA1μL，dd H2O9.5μL。反应条件：95℃5 s；95℃30 s，60℃30 s，72℃10 s，50个循环；72℃10 s。结果由Bio-Rad iQ5软件分析，通过2-△△Ct计算抗增殖蛋白基因的相对差异表达倍数。

七、Western印迹检测prohibitin蛋白的表达

弃去转染pEGFP-prohibitin、pEGFP-N1空载质粒48 h后及对照未转染空白细胞培养液，用预冷PBS洗两遍，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，收集细胞到EP管中。4℃12 000 r/min离心15 min，收集上清液。按照BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量，进行SDS-PAGE凝胶电泳。电转移至PVDF膜，Western印迹检测prohibitin，一抗为兔抗人prohibitin多克隆抗体（1∶1 000稀释），二抗为HRP标记的羊抗兔Ig G（1∶200）。ECL显色，曝光X线片。GAPDH的检测：一抗为兔抗人GAPDH多克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗兔Ig G（1∶200）。使用Syngene凝胶图像分析系统对Western印迹图像进行分析，得到条带的灰度值。将各组细胞prohibitin与内参GAPDH表达水平灰度值比进行比较［5，6］。

八、统计方法

采用SPSS16.0统计软件分析，数据多组均数比较利用单因素方差分析ANOVA，两组比较使用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结　果

一、pEGFP-prohibitin质粒的构建及鉴定

（一）prohibitin全长CDS的扩增 如图1所示，经高保真PCR得到约819 bp的prohibitin基因片段，与预期结果一致。

图1　prohibitin高保真PCR产物和双酶切pEGFP-N1产物电泳图

（二）pEGFP-prohibitin重组质粒的构建HindIII和KpnI双酶切pEGFP-N1质粒，获得一条约4.7 kb的线性质粒条带，此结果与预期结果相一致。图2显示质粒PCR鉴定结果，以pEGFP-prohibitin为模板扩增prohibitin，得到约819 bp的片段，结果与预期一致。经BLAST比对分析pEGFP-prohibitin测序结果显示与prohibitin（NM_002634.2）完全相同，插入片段为prohibitin基因，插入方向正确，读码框无移位。

图2　质粒PCR电泳图

（三）pEGFP-prohibitin和pEGFP-N1质粒的中量提取 使用Omega去内毒素质粒中量提取试剂盒抽提pEGFP-prohibitin和pEGFP-N1质粒。经紫外分光光度仪检测，pEGFP-prohibitin质粒浓度为125.6μg/ML，A260/A280比值是1.95。pEGFP-N1质粒浓度是199.6μg/ML，A260/A280比值是1.97。说明抽提的质粒质量比较好，可用于后续实验。

二、prohibitin蛋白在转染细胞中高表达的鉴定

（一）倒置荧光显微镜观察 转染24 h后，倒置荧光显微镜下观察，pEGFP-prohibitin转染组和pEGFP-N1空载转染组细胞中都可以观察到明亮的绿色荧光，但是未转染空白对照组没有观察到明亮的绿色荧光（图3）。而且荧光的强度在转染后24 h可达到最强度，此后随着时间的推移缓慢地减弱。

图3　转染后24 h三组细胞荧光显微镜及对应的光镜观察结果（HE，×40）

（二）实时PCR检测prohibitin MRNA在三组细胞中的表达 prohibitin MRNA的相对表达量用2-△△Ct值表示。转染组细胞prohibitin MRNA表达量是未转染组的5.715倍、空载转染组的2.460倍。用单因素方差分析及两两比较对三组细胞prohibitin MRNA表达量进行分析，pEGFP-prohibitin转染组prohibitin MRNA表达量明显高于另外两组（P＜0.05），这说明通过转染pEGFP-prohibitin真核表达重组质粒，prohibitin MRNA发生了表达上调。但是空载转染对照组以及未转染对照组细胞prohibitin MRNA表达差异无统计学意义（P＜0.05）。

三、Western印迹检测三组细胞内prohibitin蛋白表达差异情况

使用Western印迹方法检测48 h后转染组、空载转染组和未转染对照组三组细胞中的prohibitin表达情况（图4）。细胞中prohibitin与内参GAPDH条带的灰度，两者灰度值的比值反映了prohibitin蛋白的表达变化情况。灰度分析显示，pEGFP-prohibitin转染组细胞prohibitin/GAPDH灰度值比是0.952±0. 080，pEGFP-N1转染组细胞prohibitin/GAPDH灰度值比是0.429±0.070，未转染对照组细胞prohibitin/ GAPDH灰度值比是0.309±0.045。pEGFP-prohibitin转染组细胞prohibitin/GAPDH灰度值比分别是空载转染组的2.219倍和未转染组的3.081倍。三组细胞中的prohibitin蛋白表达差异有统计学意义（P＜0.01），转染组明显高于空载转染组和未转染组，但是空载转染组和未转染组之间不具有显著性差异。上面实验结果表明，将pEGFP-prohibitin真核表达重组质粒转染进入Hep G2细胞中后，与对照组细胞相较，prohibitin发生了表达上调。

图4　Western印迹检测三组细胞内prohibitin蛋白表达情况

讨　论

蛋白质组学技术的应用使一系列新蛋白质被发现，蛋白质是机体生物功能的主要承担者，任何疾病发生发展过程中表达异常的蛋白一定与致病机制存在着某种联系。因此，寻找表达异常的蛋白并研究其功能是探索致病机制的可行思路［10］。目前丙型肝炎的检出率逐年升高，而尚无有效疫苗能够预防HCV传播，现行的丙型肝炎的治疗方法仍然具有一定的局限，因此对其致病机制的研究及探寻新的治疗药物或方法是目前亟待解决的问题，加强对HCV感染后机体异常表达蛋白的研究则是揭示HCV感染与肝细胞相互之间作用机制的重要途径［11-13］。运用蛋白组学方法筛选HCV感染中表达异常的蛋白则是循此思路探索HCV致病机制的重要环节［14-16］。

prohibitin是一种高度保守的蛋白质，广泛分布于细菌、酵母、原虫、植物和哺乳动物等真核生物细胞中，具有高度的同源性［2］。人prohibitin基因位于染色体17q21，相对分子质量为32×103的prohibitin蛋白［17］。越来越多的研究发现prohibitin在许多肿瘤细胞中表达增强，因此推测prohibitin可能与肿瘤的发生发展有着密切的关系［6］，但是prohibitin高表达在肝脏疾病发病机制方面所发挥的作用尚不清楚［18］。

为了进一步阐明prohibitin的功能，诠释prohibitin表达上调在肝细胞损伤中所发挥的作用，本研究运用高保真PCR扩增获得prohibitin的全长编码序列，并将其插入pEGFP-N1质粒多克隆位点，构建出读码框无移位和序列正确的真核表达载体pEGFP-prohibitin。使用去内毒素质粒抽提试剂盒提取pEGFP-prohibitin和pEGFP-N1质粒，通过TurboFect转染试剂转染Hep G2细胞，通过多次实验摸索优化条件，得到最佳转染效率。进一步利用倒置荧光显微镜观察prohibitin在Hep G2细胞中的表达，通过实时PCR和Western印迹分别在MRNA水平和蛋白质水平检测prohibitin蛋白的表达情况。实验结果表明，pEGFP-prohibitin真核表达重组质粒成功转染Hep G2细胞，pEGFP-prohibitin转染组细胞prohibitin的表达量比空载转染组和未转染组细胞发生了明显增加，prohibitin在转染的Hep G2细胞中过表达，为进一步研究prohibitin高表达的生物学效应提供了基础，为了解肝脏疾病发病机制和基因治疗HCV感染提供基础实验资料和依据。

参 考 文 献

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（本文编辑：钱燕）

Establish ment and expression of recom binant pEGFP-prohibitin plasmid in HepG2 cell line

ZHAISong，SUNMing-zhu，WANGWen-jun，LIYa-ping，ZHANGXin，LIMei，DANGShuang-suo. Department of infectious diseases，thesecond affiliated hospital of medicalschool of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710004，China

【Abstract】Objective To construct eukaryotic expression plasmid of enhanced green fluorescent protein plasmids （pEGFP）prohibitin，and to observe its expression in transfected Hep G2 cells. Methods The full coding sequence of prohibitin was am plified by high fidelity poly merase chain reaction（PCR）. Mean w hile，the eukaryotic expression vector of pEGFP-prohibitin was constructed and identified by gene sequencing and basic local align ment search tool（BLAST）. Plasmids of pEGFP-prohibitin and pEGFP-N1 were extracted and transfected into Hep G2 cells by TurboFect oligofectamine reagent，expression of w hich in transfected Hep G2 cells was assessed by real time PCRat MRNAlevel and western blot at protein level. Results Recombinant pEGFP-prohibitin plasmid was successfully constructed then transfected into Hep G2 cells，prohibitin expression in w hich was apparently higher than that in Mock-vehicle and non-transfection groups. Conclusion The eukaryotic expression vector of pEGFP-prohibitin was constructed successfully，and prohibitin was confirmed to be up-regulated in Hep G2/pEGFP-prohibitin cells.

【Key words】Prohibitin；Gene expression；Recombinant plasmid；Transfection

收稿日期：（2015-07-07）

Corresponding author：DANGShuang-suo，Email：dang212@126.com

通信作者：党双锁，Email：dang212@126.com

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81170393）

作者单位：710004 西安交通大学医学院第二附属医院感染科