乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT细胞活化标志物CD38和HLA-DR表达水平与肝损伤程度相关性

陈卫红 陈艳 曾珍



乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT细胞活化标志物CD38和HLA-DR表达水平与肝损伤程度相关性

陈卫红 陈艳 曾珍

【摘要】目的 探讨乙型肝炎肝硬化（LC）患者血清iNKT细胞数量、活化标志物CD38和HLA-DR表达水平与肝损伤程度的关系。方法 采用流式细胞仪检测LC患者外周血iNKT细胞频率及CD38和HLA-DR分子在iNKT细胞上的表达水平，分析其与LC患者肝功能Child-Pugh分级、MELD评分及临床肝功能指标相关性。两组数据比较采用Mann-Whitney U检验，相关性分析采用Spearman rank检验。结果 与健康对照组相比，LC患者组iNKT细胞频率为0.106％，显著降低（P＝0.026），CD4＋iNKT细胞比例为66.7％，显著升高（P＜0.01），CD4-iNKT细胞比例为31.2％，显著降低（P＜0.01）；CD38和HLA-DR在iNKT、CD4＋iNKT和CD4-iNKT细胞上表达水平分别为14.2％、24.9％，18.8％、19.1％，18.4％、36.9％，明显升高（P＜0.05），随着Child-Pugh分级有逐渐升高的趋势，但分级之间差异无统计学意义。CD4＋iNKT细胞上CD38和HAL-DR分子表达水平与ALB呈显著负相关（r＝-0.496，P＝0.019；r＝-0.501，P＝0.018）。结论 LC患者iNKT细胞频率明显降低；活化水平显著升高，且与肝功能损害程度相关，提示iNKT细胞可能参与LC肝损伤。

【关键词】乙型肝炎肝硬化；iNKT细胞；CD4＋iNKT细胞；CD4-iNKT细胞

I型NKT细胞又称为iNKT（invariant natural killer Tcells）细胞，在人类中表达恒定TCRVα24-Jα18，可识别由CD1d分子提呈的一些内源性或外源性糖脂类抗原。活化后iNKT细胞迅速释放产生大量细胞因子，在机体内发挥免疫调节作用。近年来研究表明，免疫损伤是乙型肝炎肝硬化发生发展的重要因素，尤其是免疫细胞超活化和清除过强导致机体免疫功能低下，加重肝损伤。iNKT细胞为固有免疫细胞，在慢性乙型肝炎感染中发挥重要的抗病毒作用，并且与肝纤维化和肝损伤密切相关［1-3］。本试验通过流式细胞术检测乙型肝炎肝硬化患者外周血中的NKT细胞数和功能状态，探讨其与肝脏损伤程度的关系。

资料和方法

一、一般资料

解放军第302医院2011年4月至2012年12月收治的乙型肝炎肝硬化住院患者22例，均未接受过抗病毒治疗、免疫调节治疗或激素治疗，排除自身免疫性及酒精性肝病和肝占位性病变。同时选取17名健康人作为对照。所有入组对象临床资料见表1。乙型肝炎肝硬化患者依据Child-Push肝功能分级标准进行分级，分为Child A（n＝10），Child B（n＝7），Child C（n＝5）。本研究获解放军第302医院伦理委员会批准，所有入选患者均签署知情同意书。

二、研究方法

取入组病例清晨空腹静脉血4 ML，2000 r/min，离心半径13.5 cm，离心10 min后，沉淀用一倍的PBS稀释，混匀，小心叠加至淋巴分离液上层，分离PBMC，取150万PBMC重悬于100μL的PBS中，按照推荐剂量加入荧光标记的单克隆抗体6B11-PE、CD3-APC/Cy7、CD4-PE/Cy7、CD38-FITC和HLADR-PerCp，4℃避光孵育30 min，加入1 MLPBS，振荡混匀，1500 r/min离心5 min。最后加入250μL1％的多聚甲醛溶液，上机检测。

三、统计学处理

所有数据分析采用SPSS13.0软件，结果以均数±标准误表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，两组比较采用Mann-Whitney U检验。相关性分析采用Spearman rank检验。所有分析采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结　果

一、乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT细胞频率及亚群的变化

乙型肝炎肝硬化患者外周血中iNKT细胞的频率，选取CD3和6B11双阳性细胞为iNKT细胞，根据是否表达CD4，将iNKT细胞分为CD4＋iNKT和CD4-iNKT细胞两个亚群。结果乙型肝炎肝硬化患者iNKT细胞频率显著低于健康对照组（P＝0.026），Child A、B和C3组之间差异无统计学意义。CD4＋iNKT细胞在所有iNKT细胞中所占比例显著升高（P＜0.01），而CD4-iNKT细胞所占比例显著下降（P＜0.01）。见图1。

二、乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT及亚群细胞表面活化标志物CD38和HLA-DR表达水平

根据iNKT细胞表面CD38和HLA-DR表达水平不同，评价iNKT细胞的活化程度。乙型肝炎肝硬化患者iNKT细胞及亚群表面活化标志物CD38和HLA-DR表达水平显著下降，统计分析结果如图2所示，乙型肝炎肝硬化患者iNKT细胞表面CD38和HLA-DR分子的表达水平显著低于健康对照（Z值分别为-5.138和-4.130，均P＜0.01）。在CD4＋iNKT细胞亚群上，乙型肝炎肝硬化患者CD38和HLA-DR分子表达水平显著高于健康对照组（Z值分别为-3.186和-4.143，均P＜0.01）。同样在CD4-iNKT细胞亚群上，乙型肝炎肝硬化患者CD38和HLA-DR分子表达水平也显著高于健康对照组（Z值分别为-5.340和-5.314，均P＜0.01）。

表1　入组对象临床资料

图1　乙型肝炎肝硬化患者iNKT细胞及亚群频率

图2　乙型肝炎肝硬化患者iNKT细胞表面活化标志物表达水平

三、乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT及亚群CD38和HLA-DR表达水平与肝功能相关性分析

进一步分析乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT及亚群频率、活化标志物表达水平与ALT、AST、Alb、PTA、TBil及MELD分值之间的相关性，统计分析结果见图3所示，CD38在CD4＋iNKT细胞上表达水平与Alb呈显著负相关（r＝-0.496，P＝0.019）。HLA-DR在CD4＋iNKT细胞上表达水平与Alb呈显著负相关（r＝-0.443，P＝0.039）。CD38和HLADR在iNKT及亚群上表达水平与PTA、TBil及MELD分值之间无明显相关性。iNKT细胞频率及亚群比值与ALT、AST、Alb、PTA、TBil及MELD分值之间之间无明显相关性。

图3　iNKT细胞表面活化标志物表达水平与白蛋白相关性

讨　论

NKT是一类天然存在的介导先天免疫和获得性免疫的新型免疫调节细胞，是具有NK受体及功能的T细胞亚群，能特异性识别CD1d递呈的糖脂类抗原，是肝脏固有免疫系统的重要组成部分之一。有学者认为，NKT细胞以CD3＋CD56＋作为表面标志［4］，但近年来研究认为CD3＋CD56＋细胞为细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cell，CIK细胞）主要的效应细胞，CIK细胞表面也同时表达T细胞和NK细胞的表面标志，是一类NKT样细胞群［5］。国内有些研究将NKT细胞完全等同于CD3＋CD56＋CIK细胞［6，7］。目前利用流式细胞术鉴定iNKT细胞的试剂，如负载α-Galcer的CD1d多聚体、单抗6B11（特异针对Vα24-Jα18 TCR）、Vα24和Vβ11单抗联合使用都是鉴定iNKT细胞的试剂［8-10］。单独用Vα24特异性单抗能鉴定大部分的iNKT细胞，但是一些非iNKT细胞也表达Vα24［11，12］。该研究使用的是抗iNKT细胞Vα24Jα18的单抗6B11，6B11和CD3双阳性淋巴细胞定义为iNKT细胞，是目前用流式细胞术鉴定人类iNKT细胞最严谨的方法。由于iNKT细胞在外周血中所占比例较低，首先从全血中分离PBMC，利用多色流式细胞仪能够提供更多数据的长处，同时每个样本收集PBMC细胞数在50万以上，增加所分析的iNKT细胞数量，减少人为误差。

大量的研究已证实，肝脏内iNKT细胞在HBV感染中的抗病毒作用。有报道显示，在慢乙型肝炎患者外周血iNKT细胞频率降低，并且与抗病毒疗效有关［13，14］。该研究发现在乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT细胞频率也是降低的，但并未发现与外周血中病毒载量及肝功能指标有明显相关性，可能是乙型肝炎肝硬化是HBV感染的终末期肝病，有些患者病毒载量在检测的下限。相反，黄晓刚等［12］研究显示，健康人组与乙型肝炎肝硬化组NKT细胞无明显的统计学差异，由于该作者是以Vα24单抗鉴定的NKT细胞，与本研究的iNKT细胞有所不同。iNKT细胞频率与病毒载量的关系，有待加大样本量，并且纳入不同感染期的慢乙型肝炎患者作为对照，动态观察iNKT细胞频率和病毒载量的关系。乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT细胞降低的原因尚不清楚，有可能是免疫调节的作用，iNKT细胞募集到肝脏中发挥抗病毒作用，也有可能是iNKT活化后标志物TCR表达下调或凋亡［13，14］，使能检测到的iNKT细胞数量偏低。

DC细胞产生IL-12和HBV诱导的磷脂抗原均可能促进iNKT1细胞的活化［15］。该研究检测了iNKT细胞表明活化标志物CD38和HLA-DR分子的表达水平，结果发现乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT细胞上CD38和HLA-DR的表达水平显著高于健康对照，并且与患者肝功能生化指标明显负相关。上述研究提示乙型肝炎肝硬化患外周血iNKT细胞处于活化状态，在疾病发生发展过程中发挥着重要作用，与肝损伤有关，但是iNKT细胞参与肝损伤的具体作用机制有待深入研究。

本研究检测了乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT细胞及亚群的频率和活化水平，并分析了与肝功能的相关性，结果发现乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT细胞频率显著降低，CD4＋iNKT细胞所占比例显著升高，CD4-iNKT细胞比例显著减低，活化水平显著升高且与肝功能损害程度相关。

参 考 文 献

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（本文编辑：钱燕）

Elevated expression of activation marker CD38 and HLA-DRon peripheral blood iNKTcell and their correlation with liver injury in patients with HBV-related liver cirrhosis

CHENWei-hong，CHENYan，ZENGZhen. Departmentof Nutrition and Related Diseases，NationalInstitute for Nutrition and Food Safety，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China

【Abstract】Objective To investigate potential correlation between frequency of peripheral blood invariant nature killer T（iNKT）cell，expression of activation markers CD38 or HLA-DRand severity of hepatic injury in patients with hepatitis Bvirus（HBV）-related liver cirrhosis（LC）. Methods Frequency of peripheral blood iNKTcells and expression of CD38 or HLA-DRMolecules were detected by flow cyto metry to analyze their correlations with Child-Pugh score，Model of end-stage liver disease（MELD）score and seru Mbiochemical parameters for liver function in HBV-related LCpatients. comparison and correlation analysis between the two groups were performed by Mann-Whitney Utest and Spearman rank test，respectively. Results When compared to healthy controls，LCpatients displayed significantly lower frequency of iNKTcells and proportion of CD4-iNKTcells（0.106％，P＝0.026；31.2％，P＜0.01），w hile higher proportion of CD4＋iNKTcells（66.7％，P＜0.01），higher expression of CD38 and HLA-DRMolecules on iNKT，CD4＋iNKTand CD4-iNKTcells（14.2％，24.9％，18.8％，19.1％，18.4％，36.9％respectively，P＜0.05），respectively. However there was no statistically different expression of CD38 and HLA-DRam ong different Child-Pugh score. Mean w hile，expression of CD38 and HLA-DRon CD4＋iNKTcells was negatively correlated with albu min level（r＝-0.496，P＝0.019；r＝-0.501，P＝0.018）. Conclusion compared to those in healthy controls，peripheral blood iNKTcells in LCpatients manifested significantly lower frequency，but higher cellular activation level w hich was associated with aggravation of hepatic injury.In another word，iNKTcells might play a role in the pathogenesis of liver injury in LCpatients.

【Key words】iNKTcell；CD4＋iNKTcell；CD4-iNKTcell；Liver cirrhosis

收稿日期：（2015-07-15）

Corresponding author：ZENGZhen，Email：zengzhen1970@sina.com

通信作者：曾珍，Email：zengzhen1970@sina.com

基金项目：军队“十二五”课题（CWS12J024）；国家自然科学基金资助项目（81372248）

作者单位：100050 北京 中国疾病预防控制中心营养与健康所营养与疾病室（陈卫红）；解放军第三○二医院肝脏肿瘤诊疗与研究中心（陈艳，曾珍）