新型2-溴苯酰胺类小分子CCR5拮抗剂的合成及其GTPγS结合性

程德军， 黄　斌， 杨　郭

(四川理工学院 材料与化学工程学院，四川 自贡　643000)



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新型2-溴苯酰胺类小分子
CCR5拮抗剂的合成及其GTPγS结合性

程德军， 黄斌， 杨郭*

(四川理工学院 材料与化学工程学院，四川 自贡643000)

摘要：以2-羟基-5-溴苯甲醛为起始原料，经取代,还原和NBS溴化反应制得5-溴-2-(4-氯苯甲氧基)溴甲苯(3)；以4-哌啶酮盐酸盐为原料，经保护,还原和缩合反应制得N-烯丙基-2-溴-N-哌啶基苯酰胺(7)； 3和7经取代反应合成了一个新型的非肽类小分子CCR5拮抗剂——N-烯丙基-2-溴-N-{N-[2-(4-氯苯甲氧基)-5-溴苄基]-4-哌啶基}苯酰胺(8)，总产率32.5%,其结构经1H NMR，13C NMR， IR和ESI-MS表征。用GTPγS法测试了8的生物结合性。结果表明：8的生物结合性与TD0232接近，其IC50为(8.12±0.3) nmol·L-1。

关键词：2-羟基-5-溴苯甲醛; 5-溴-2-(4-氯苯甲氧基)溴甲苯;N-烯丙基-2-溴-N-哌啶基苯酰胺; CCR5拮抗剂; 非肽类小分子； 合成； GTPγS结合性

通信联系人： 杨郭，副教授， E-mail: yangguo0813@163.com

近年来，趋化因子受体CCR5作为介导HIV-1病毒进入细胞的研究受到生物医学工作者的广泛关注。研究发现，具有特定结构的非肽类小分子化合物可以与趋化因子RANTES竞争性地结合CCR5，使CCR5发生特定的基因突变[1]，使抑制趋化因子受体CCR5与巨噬细胞炎症蛋白MIP-1α结合，用于治疗人类感染HIV-1[2-4]。日本Takeda Chemical Industries公司开发的TAK-652和美国Schering-Plough公司开发的SCH-D已进入临床III期研究。这类突变基因型非肽类小分子化合物作为一种新型的CCR5拮抗剂具有很大的开发潜力。

一般来说，突变基因型非肽类小分子化合物只能结合单一位点的CCR5，效果有限。为增加苯酰胺类小分子的结合位点，提高CCR5拮抗剂的生物结合性，在分子结构设计时应作如下考虑[5]：酰胺结构和哌啶结构中含有叔氮原子，连接基团为哌啶环状结构，引入疏水基团。

本文依据活性结构设计原理，以2-羟基-5-溴苯甲醛为起始原料，经取代、还原和NBS溴化反应制得5-溴-2-(4-氯苯甲氧基)溴甲苯(3)；以4-哌啶酮盐酸盐为原料，经保护、还原和缩合反应制得N-烯丙基-2-溴-N-哌啶基苯酰胺(7)； 3和7经取代反应合成了一个新型的非肽类小分子CCR5拮抗剂——N-烯丙基-2-溴-N-{N-[2-(4-氯苯甲氧基)-5-溴苄基]-4-哌啶基}苯酰胺(8， Scheme 1)，总产率32.5%,其结构经1H NMR，13C NMR， IR和ESI-MS表征。用GTPγS法[7]测试了8的生物结合性。结果表明：8的生物结合性与TD0232接近，其IC50为(8.12±0.3) nmol·L-1。

Scheme 1

1实验部分

1.1仪器与试剂

Bruker AV 600 MHz型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；TENSOR27型傅立叶变换红外光谱仪(KBr压片)；AGILENT MSD VL型质谱仪。

1~3按文献[8]方法合成；GDP, GTPγS和[35S]GTPγS(1 200 Ci·mmol-1), Sigma公司；CHO-K1细胞(ATCC)，DuPont-NewEngland Nuelear公司。

1.2合成

(1)N-Boc-哌啶酮(4)的合成

在反应瓶中依次加入丙酮60 mL，水360 mL和4-哌啶酮盐酸盐18.30 g(0.12 mol)，搅拌下缓慢滴加二碳酸二叔丁酯27.50 g(0.13 mol)的丙酮(60.0 mL)溶液，滴毕，回流反应12 h。蒸除溶剂，残余物加水30 mL，用乙酸乙酯(2×40 mL)萃取，合并萃取液，蒸除溶剂得白色固体4 22.81 g，产率95.4%， m.p.86.8~88.3 ℃;1H NMRδ: 1.46(s, 9H, CH3), 2.56(t,J=7.1 Hz, 4H, CH2), 3.74(t,J=7.1 Hz, 4H, CH2); ESI-MSm/z: 299.26[M+]。

(2) 4-烯丙胺-N-Boc哌啶(5)的合成[9]

在反应瓶中依次加入3-氨基丙烯1.95 g(34 mmol)， 4 2.38 g(30 mmol)， THF 80.0 mL和甲醇12.0 mL，搅拌20 min；缓慢滴加三乙酰氧基硼氢化钠(STAB)9.50 g(45 mmol)，滴毕，于室温反应至终点。冷却至室温，倒入30.0 mL水中，用乙酸乙酯(150 mL)萃取，水层调至pH 10后用乙酸乙酯(100 mL)萃取，合并萃取液，蒸除溶剂得黄色油状液体5 5.60 g，产率78.1%；1H NMRδ: 1.61(s, 9H, CH3), 1.72~1.86(m, 4H, CH2), 2.72(m, 1H, CH), 3.22(m, 2H, CH2), 3.38(s, 1H, NH), 3.51~3.65(m, 4H, CH2), 5.63(m, 1H, C=CH), 5.91(m, 1H, C=CH); ESI-MSm/z: 240.15[M+]。

(3)N-烯丙基-2-溴-N-(N-Boc哌啶基)苯酰胺(6)的合成

在反应瓶中依次加入CH2Cl225 mL， 1-羟基苯并三唑(HOBT)0.60 g和2-溴苯甲酸1.20 g(6 mmol)，搅拌30 min；加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)0.80 g和5 1.21 g(5 mmol)，回流反应至终点(TLC检测)。倒入50.0 mL水中，用二氯甲烷(2×50 mL)萃取，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤，浓缩后经硅胶柱层析[洗脱剂：A=V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=10 ∶1]纯化得黄色油状液体6 1.67 g，产率79.1%；1H NMRδ: 1.47(s, 9H, CH3), 1.82~1.96(m, 4H, CH2), 3.33~3.47(m, 4H, CH2), 3.68(m, 1H, CH), 3.89(m, 1H, CH), 5.10(m, 2H, CH), 5.80(m, 1H, C=CH), 7.32~7.60(m, 4H, ArH); ESI-MSm/z: 445.31, 447.27{[M+Na]+}。

(4) 7的合成

在反应瓶中依次加入二氯甲烷15.0 mL， 6 1.27 g(3 mmol)和三氟乙酸(TFA)2.00 mL，搅拌下回流反应至终点(TLC检测)。蒸除溶剂，残余物加入二氯甲烷15.0 mL，蒸除残余TFA，加入乙酸乙酯80 mL，过滤，滤液用饱和食盐水洗涤，蒸除溶剂得无色油状液体7 0.73 g，产率85.8%；1H NMRδ: 1.29~1.35(m, 4H, CH2), 2.20(s, 1H, NH), 2.52~2.61(m, 4H, CH2), 3.74(m, 1H, CH), 3.91(m, 2H, CH2), 5.41(m, 2H, C=CH), 5.88(m, 1H, C=CH), 7.50(m, 2H, ArH), 7.75(m, 1H, ArH), 7.85(m, 1H, ArH);13C NMRδ: 30.7, 44.8, 49.2, 63.3, 116.3, 119.4, 126.5, 128.9, 132.8, 134.7, 138.5, 164.2; ESI-MSm/z: 322.12, 322.16[M+]。

(5) 8的合成

在反应瓶中依次加入DMF 15.0 mL，碳酸钾0.17 g， 3 0.40 g(1 mmol)和7 0.32 g(1 mmol)，搅拌下回流反应至终点(TLC检测)。倒入50 mL水中，摇匀，用乙酸乙酯(2×100 mL)萃取，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤，浓缩后经硅胶柱层析(洗脱剂：A=10 ∶1)纯化得白色固体8 0.43 g，产率78.3%， m.p.380.5~385.1 ℃；1H NMRδ: 1.42~1.47(m, 4H, 16,18-H), 1.58~1.68(m, 4H, 15,19-H), 3.65(m, 1H, 17-H), 3.97(s, 2H, 14-H), 4.10(m, 2H, 20-H), 5.27(s, 2H, 7-H), 5.36(m, 2H, 22-H), 6.16(m, 1H, 21-H), 6.61~6.72(m, 5H, 3,5,10,12,13-H), 7.23~7.35(m, 4H, 2,6,27,28-H), 7.78(dd,J=2.5 Hz, 9.5 Hz, 1H, 26-H), 7.92(dd,J=2.5 Hz, 9.5 Hz, 1H, 29-H) ;13C NMRδ: 29.6, 30.1, 30.2, 32.0, 45.2, 46.6, 52.7, 53.5, 55.9, 57.8, 69.7, 113.7, 116.9, 118.3, 119.7, 122.2, 124.6, 128.7, 128.4, 129.3, 129.8, 130.2, 130.9, 131.8, 132.8, 133.6, 133.9, 134.2, 134.6, 134.9, 135.6, 141.5, 154.7, 167.4, 169.1; IRν: 3 078(C-H), 1 665(C=O), 1 614, 1 565, 1 474(C=C), 1 262(C-O-C) cm-1; ESI-MSm/z: 630.16, 632.10[M+]。

1.3GTPγS活性测定[10]

配制缓冲液(10 mmol·L-1EDTA， 10 mmol·L-1Tris-HCl和10 mmol·L-1EGTA)，调至pH 7.5，加入CHO-K1细胞，混合均匀；用胰岛素针筒抽吸5次，离心，滤渣加入缓冲液体系(pH 7.5, 1.0 mmol·L-1EDTA， 5.0 mmol·L-1MgCl2， 100 mmol·L-1NaCl和50 mmol·L-1Tris-HCl)中，加入10 nmol·L-1[35S]GTPγS和50 mmol·L-1GDP，于30 ℃温育，分别加入TD-0232[11]和8，当被测物抑制率为50%时，测定液闪计数。

2结果与讨论

2.1合成

参照文献[11]方法，采用Boc保护哌啶氮原子的方法，以2-羟基-5-溴苯甲醛为起始原料合成了8，总产率32.5%。该方法路线较短，反应条件较温和。

8符合预期设计要求，即酰胺结构和哌啶结构中含有叔氮原子，在生理pH值条件下均可质子化，形成具有生物活性的季氮原子；中间连接结构为环状哌啶基；引入疏水基团(溴原子和氯原子)，增强了受体结合性。

2.2GTPγS活性

用Sigmaplot绘图计算8的IC50为(8.12±0.3) nmol·L-1，与TD-0232[IC50=(3.1±0.3) nmol·L-1]接近。

此外，通过[35S]GTPγS结合实验还发现, 当被测物抑制率达到50%时，8与TD0232均可激活CHO-K1细胞膜上的蛋白, 说明8能与膜上某种“受体”结合，进入胞质溶胶，直接使核糖体失活, 从而抑制蛋白质合成并导致CHO-K1细胞死亡。因此，与TD0232作用机理类似，8也可通过与趋化因子RANTES竞争性地结合CCR5，使CCR5发生特定的基因突变，进而预防人类感染HIV-1病毒。

3结论

合成了2-溴苯酰胺类小分子拮抗剂——N-烯丙基-2-溴-N-(1-(2-(4-氯苯甲氧基)-5-溴苄基)-4-哌啶基)苯酰胺(8)。8的[35S]GTPγS活性[IC50=(8.12±0.3) nmol·L-1]与抗艾滋药TD0232接近。

8的合成路线较短，产率较高，成本较低，有望作为抗HIV-1药物开发的候选药物。

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Synthesis and GTPγS Binding Activity of

Novel 2-Bromo-benzamides Small Molecule CCR5 Antagonists

CHENG De-jun,HUANG Bin,Yang Guo*

(College of Materials and Chemical Engineering， Sichuan University of Science and Engineering， Zigong 643000, China)

Abstract：5-Bromo-1-[(4-chlorobenzyl)oxy]-2-bromotoluene(3) was obtained by substitution reaction, reduction and NBS bromination from 5-bromo-2-hydroxybenzaldehyde.N-allyl-2-bromo-N-(4-piperidinyl)benzamide(7) was prepared by protection, reduction and condensation reaction from 4-piperidone hydrochlorid. A novel non-peptide small molecule compound,N-allyl-2-bromo-N-【1-{2-[(4-chlorobenz)oxyyl]-5-bromobenz}-4-piperidin】 benzamide(8) with total yield of 32.5%, was synthesized by substitution reaction of 3 with 7. The structure was characterized by1H NMR，13C NMR， IR and ESI-MS. The biological activity of 8 was detected by the SPA GTPγS assay. The results indicated that the biological binding activity of 8 approach to TD0232 with IC50of (8.12±0.3) nmol·L-1.

Keywords：5-bromo-2-hydroxybenzaldehyde; 5-bromo-1-[(4-chlorobenzyl)oxy]-2-bromotoluene;N-allyl-2-bromo-N-(4-piperidinyl)benzamide; CCR5 antagonist; non-peptide small molecular; synthesis; GTPγS binding activity

作者简介：程德军(1976-)男，汉族，四川仁寿人，硕士，主要从事药物合成的研究。 E-mail: 80131515@163.com

基金项目：四川省教育厅科研项目(15ZB0215)； 四川省自贡市重点科技计划项目(2014ZC01)

收稿日期：2015-10-28;

修订日期：2015-12-23

中图分类号：O621.3； R914.5

文献标志码：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.02.15358